论文摘要
本研究以拟南芥为材料,利用改良的农杆菌介导法将T-DNA导入拟南芥野生型植株,获得T-DNA导入突变,进行了特异PCR扩增、PCR-Southern杂交检测,结果证明T-DNA片段整合到了受体的基因组中;由于T-DNA插入点一般在转录调控区,得到了插入在PLDα1调控区对赤霉素不敏感的突变体,并出现了大量的矮化株。PLDα1表达量受到了影响,在植株生长后期,用脱落酸处理,植株的衰老延迟,具体结果如下:1.T-DNA插入标签群体的获得。用改造的PKYL7质粒和哥伦比亚野生型拟南芥为材料,通过改良的农杆菌浸染法,获得了拟南芥T-DNA插入标签群体。在盆栽选择和PCR选择的基础上,进行PCR-Southern杂交检测验证,结果证明T-DNA已经整合到拟南芥基因组中。2.T-DNA标签系的T0,T1代表型鉴定。通过观察,对拟南芥T-DNA标签系T0、T1代表型性状进行了鉴定,发现有以下几种类型:（1）矮秆,株高降低程度不一,T0代个别株高仅为7.5 cm,不结实。（2）早熟,程度不一,其中T0-01从种植到成熟仅25天。（3）生长能力有差异,T1代发现单茎及弱势生长的植株。（4）在T0中出现一定比例的白化苗,到抽苔后死亡。但仍有一株叶片白绿镶嵌,但结实较少。（5） T0代发现有不育株。3.拟南芥繁育技术试验。选用了3种培养方法进行拟南芥繁育技术试验:移栽法、蛭石法、5∶5法。在室内室温（26℃左右）和人工光照（白色荧光灯,16h光照,8h黑暗）条件下培养。在不同的培养条件下,野生型拟南芥均可很好的生长。但不同的培养方法,拟南芥的生长也有所不同:移栽法成活率较低,始花期延迟,初花高度矮,莲座数少,但生活周期变化不大,稍有延长。4.赤霉素不敏感突变体的筛选。对转基因T-DNA标签系进行赤霉素筛选,得到了对赤霉素不敏感的突变株。采用浓度为50、100、150PPM的赤霉素进行处理,生长受到影响,但相差不大,只是苗期生长受到影响较大。用如此大剂量赤霉素处理,突变株能较正常生长而未受到伤害,而未用赤霉素处理的植株几乎不能发芽,可以说明该突变株为赤霉素不敏感突变体。5.突变体和野生型拟南芥比较试验。结果表明突变体植株生长矮小,根伸长比较慢,差异显著。营养生长期的缩短势必造成营养生长和生殖生长的不足,生育期缩短。突变体花发育受到影响,造成花少,花小,甚至有的植株出现雄性不育现象,这可能和突变体营养生长有关。6.突变体遗传分析。突变体自交三代纯化后与野生型杂交,检测F1和F2代株高。结果表明,F1代株高有所提高,但又低于野生型,称之为中间型。而F2则出现高株、矮株、中间株三者的分离,比例是1:1:2,如果将中间株归于高株,可以呈现1:3的分离。这样看来,该突变是共显性突变。7.脱落酸处理分析。ABA处理24h后,叶绿素、SOD、POD、丙二醛含量、测定表明,Ws型受到影响较大,而PLDa1略有变化但不明显。8.赤霉素不敏感突变体插入位点的估测。通过生物软件在线查找和分析,T-DNA插入点在结构基因PLDα1的转录调控区,致使在激素存在下不能很好的转录表达,既对激素信号反应不敏感,而导致PLDα1表达量减少,脱落酸处理试验也能提供一定的证据。