微卫星DNA及ISSR技术在原生动物中的应用研究

论文摘要

首次把微卫星DNA以及相关的ISSR（inter simple sequence repeat）技术引入自由生活原生动物分子生物学领域。 一、对原生动物微卫星引物特异性和适用性进行了研究，采用寄生种类克氏锥虫的8个微卫星引物在4种自由生活的原生动物基因组上进行PCR扩增，取8条300-500bp扩增条带进行回收、克隆和测序。但测序结果所有种类都未得到相应微卫星DNA序列，表明在同一目以及更高分类单元扩不出相应的微卫星位点，原生动物微卫星引物特异性高。 二、运用探针杂交的方法从基因组中筛选微卫星位点。将随机引物分别对嗜热四膜虫和小眼虫进行随机多态DNA（RAPD，Random Amplification of Polymorphic DNA）扩增，建立部分基因组库，并通过Southern杂交和原位杂交，选择阳性核酸带测序。从70个RAPD体系中，独立筛选和鉴定8个微卫星位点序列，并估计了它们在基因组中的丰度。这是在自由生活原生动物中筛选微卫星的首次报道。研究表明：1)与哺乳动物相同，在这两种原生动物的基因组中CT重复显著多于GT重复；2)四膜虫总DNA中微卫星GT，CT重复的丰度显著小于小眼虫，并进一步探讨了原因可能是纤毛虫大核DNA的特性所致；3)发现大量的单核苷酸多聚A和T，推测是在逆转录转座时产生。 进而，运用ISSR技术对某些纤毛虫进行了遗传关系和种群遗传学的研究。 一、用13个ISSR引物对五株纤毛虫进行扩增，六个ISSR引物获得多态性片段。根据Nei氏遗传距离矩阵构建了五株纤毛虫的遗传关系树状图。UPGMA，NJ聚类图表明：两株嗜热四膜虫最先聚在一起；其次是褶累枝虫和多态喇叭虫聚在一起，然后再与嗜热四膜虫聚在一起；咽膜亚纲的绿草履虫形成独立的一枝。结果显示：1)缘毛亚纲纤毛虫可能是寡膜纲中较独特的一个类群，建议提升缘毛亚纲纤毛虫的分类地位；2)缘毛亚纲褶累枝虫与膜口亚纲嗜热四膜虫的亲缘关系近于咽膜亚纲绿草履虫，在寡膜纲中绿草履虫处于原始地位；3)五株纤毛虫基因组中均含有微卫星DNA序列：（GTG）4、（GACA）4、（AG）8、（CAA）6和（GAA）6。 二、在五种缘毛类纤毛虫中进行遗传关系的ISSR研究，由UPGMA，NJ聚类图显示：伞形钟虫首先分离出来；螅状独缩虫和金龟累枝虫聚在一起。对比由核糖体小亚基RNA基因序列构建的系统发育树，发现：1)螅状独缩虫与累枝虫的关系近

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 中文目录
• 第一部分 研究综述
• 第一章 微卫星DNA遗传分析在原生动物学中的研究进展
• 1 微卫星DNA遗传标记简介
• 1.1 微卫星DNA的发现
• 1.2 微卫星DNA的性质
• 1.3 微卫星DNA的研究方法
• 2 微卫星DNA在原生动物研究中的应用
• 2.1 群体遗传学研究
• 2.2 检测寄生原生动物
• 2.3 高分辨率的种株鉴定和基因分型
• 2.4 寄生原生动物与寄主关系分析
• 2.5 基因定位用于构建遗传连锁图谱
• 3 研究前景
• 3.1 对微卫星局限性的改进方法
• 3.2 微卫星DNA在原生动物学研究中的展望
• 3.2.1 遗传多样性
• 3.2.2 原生动物遗传关系的研究
• 第二章 ISSR分子标记技术研究进展
• 1 ISSR分子标记技术的原理和特点
• 2 ISSR的实验技术要点
• 3 ISSR的应用
• 3.1 种株鉴定
• 3.2 物种和种群亲缘关系研究
• 3.3 检测种群的遗传多样性
• 第二部分 微卫星DNA
• 第三章 寄生类原生动物的微卫星引物在自由生活原生动物中适用性研究
• 1 前言
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料的培养
• 2.2 DNA提取
• 2.3 PCR和电泳条件
• 2.4 连接和转化
• 2.5 克隆测序
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 微卫星引物的适用性和微卫星位点的特异性
• 4.2 微卫星位点的筛选
• 第四章 小眼虫和嗜热四膜虫微卫星DNA的筛选、克隆和特征分析
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料的培养
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 RAPD扩增和电泳的条件
• 1.4 Southern杂交
• 1.5 连接和转化
• 1.6 原位杂交和阳性克隆的测序
• 1.7 微卫星的扩增
• 2 结果
• 2.1 RAPD指纹图谱
• 2.2 Southern杂交和原位杂交
• 2.3 原位杂交
• 2.4 微卫星位点
• 2.5 小眼虫基因组中微卫星DNA的丰度
• 2.6 单核苷酸重复
• 3 讨论
• 3.1 微卫星DNA的丰度
• 3.2 单核苷酸重复
• 3.3 纤毛虫和鞭毛虫之间的比较
• 3.4 关于RAMS方法
• 第五章 七株眼虫基于微卫星DNA指纹图谱的区分和关系分析
• 1 实验材料和方法
• 1.1 种株来源
• 1.2 DNA提取
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 聚丙烯酰胺电泳
• 1.5 数据分析
• 2 实验结果
• 2.1 形态比较
• 2.2 微卫星DNA指纹
• 2.3 遗传变异
• 2.4 相似树
• 3 讨论
• 3.1 株系区分和微卫星DNA指纹标记的优点
• 3.2 种之间的关系
• 第三部分 ISSR技术
• 第六章 五株纤毛虫遗传关系的ISSR分析
• 1 材料和方法
• 1.1 样品的采集、分离和DNA提取
• 1.2 ISSR-PCR扩增
• 1.3 数据分析
• 2 结果
• 2.1 电泳结果
• 2.2 遗传距离
• 2.3 遗传关系树
• 3 讨论
• 3.1 缘毛类纤毛虫分类地位分析
• 3.2 寡膜纲中三亚纲纤毛虫间的遗传关系分析
• 3.3 纤毛虫基因组中微卫星DNA
• 第七章 五种缘毛类纤毛虫遗传关系的ISSR研究
• 1 实验材料和方法
• 1.1 种类来源和DNA提取
• 1.2 ISSR-PCR扩增
• 1.3 电泳条件
• 1.4 ISSR数据分析
• 1.5 SSrRNA基因数据分析
• 2 实验结果
• 2.1 ISSR指纹图谱
• 2.2 遗传变异
• 2.3 系统发育树
• 3 讨论
• 3.1 Carchesium polypinum的系统发育地位
• 3.2 三种Epistylis的遗传关系
• 3.3 SSrRNA基因序列分子树的缺点和ISSR分子标记的优点
• 第八章 螅状独缩虫种群遗传结构的ISSR分析：多样性高而种群分化低
• 1 实验材料和方法
• 1.1 样品来源
• 1.2 DNA提取
• 1.3 ISSR-PCR扩增和PCR条件的优化
• 1.4 电泳条件
• 1.5 数据分析
• 2 实验结果
• 2.1 ISSR扩增图谱
• 2.2 遗传多样性和遗传变异
• 2.3 株之间的遗传关系
• 2.4 遗传距离和地理距离之间的关系
• 3 讨论
• 3.1 高遗传多样性
• 3.2 低种群分化
• 3.3 遗传距离和地理距离之间的关系
• 3.4 生物地理格局
• 总结
• 参考文献
• 附件一 攻读博士期间发表文章及奖励
• 致谢