miR-196a2单核苷酸多态性与白癜风易感性的关联及机制研究

论文摘要

白癜风是皮肤科常见的获得性色素脱失性疾病，以皮损部位黑素细胞明显减少或消失为特征。黑素细胞破坏或凋亡的机理迄今尚未完全阐明，白癜风的发病机制的研究多集中在自身免疫、神经因子、氧化应激、代谢毒素、遗传等学说。越来越多的学者认为，白癜风的发生和进展是多因素多基因共同作用的，其中基因遗传变异决定个体罹患白癜风的易感性。另外越来越多的研究显示白癜风发病与氧化应激密切相关，白癜风患者皮损区出现过量H2O2的蓄积。microRNA（miRNA）是约22个核苷酸长度的非编码小分子RNA，从具有一个或多个发夹样结构的前体pre-miRNA加工而来。miRNA通过与靶信使RNA（mRNA）的3’非翻译区（3’-UTR）结合对转录后水平发挥负调节作用，使mRNA翻译抑制或降解，在机体的多种生理和病理过程中有重要作用。有研究显示人类大约60%编码蛋白基因受到miRNA的调控。单核苷酸多态性（SNP）是人类基因中最常见的基因变异，可影响基因的表达、转录、翻译、修饰，是疾病易感性和导致药物反应性个体和种族差异的重要原因之一。研究表明miRNA的SNP与多种人类疾病相关，可以影响疾病的表型或发生发展，目前肿瘤性疾病如肺癌、乳腺癌、肝癌等研究较多，在一些非肿瘤性疾病如小儿先心病、煤工尘肺等中也有研究。明确位于miRNA的SNP是否与白癜风的易感性有关联，寻找到与白癜风发生发展可能相关的miRNA，初步探讨其SNP对黑素细胞功能有无影响，可能对白癜风的发生机制及临床治疗提供新的理论依据。方法：通过公共miRBase数据库和文献查找所有miRNA，筛检并确认pre-miRNA中MAF>5%的SNP位点及在中国人群中的分布情况。应用分子流行病学病例-对照的研究方法，PCR-RFLP的实验方法，探讨miRNA的SNP与白癜风易感性的关联性。筛选出与白癜风易感性相关miRNA分子，并构建不同基因型miRNA分子的真核表达质粒，瞬时转染黑素细胞PIG1，通过检测黑素细胞活力、凋亡和超微结构变化，观察miRNA单核苷酸多态性对H2O2诱导氧化应激下黑素细胞生物学的影响。之后对筛检出的相关miRNA应用生物学预测软件进行靶基因的预测，并通过双荧光素酶报告基因实验验证miRNA和预测靶基因之间的关系。检测转染不同质粒组黑素细胞中黑素合成量和酪氨酸酶活性，以及H2O2处理黑素细胞后各组ROS水平的变化，通过以上功能学实验进一步验证miRNA单核苷酸多态性对靶基因的调控以及黑素细胞损伤的影响。结果：1.从400个已知的人类pre-miRNA中确定了课题组研究的4个miRNA的SNP位点：miR-146a rs2910164，miR-149rs2292832，miR-196a2rs11614913，miR-499rs3746444，在819例白癜风病例组及817例对照组中鉴定出4个研究位点的基因型，通过统计学分析发现，具有miR-196a2CC基因型的个体与TT和TC的联合基因型相比白癜风的易感性降低。在其它3个miRNA鉴定的基因型分析结果中没有显示出类似的主效应。.对miR-196a2rs11614913CC基因型与TT和TC联合基因型进行了分层分析。观察到白癜风易感性的降低主要表现在以下组别中：年龄大于20岁，女性，散发型白癜风，无白癜风家族史，不伴有其它自身免疫性疾病，病史超过1年的患者。2.成功构建了miR-196a2的表达质粒pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C。H2O2诱导的氧化应激下，CCK-8结果显示转染pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C表达质粒组黑素细胞的活力无显著性差异。流式细胞术结果显示，转染pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C表达质粒组的黑素细胞早期凋亡率均有显著降低（P<0.05），并且pCDNA3.1-miR-196a2-C和pCDNA3.1-miR-196a2-T相比凋亡也显著减少（P <0.05）。透射电镜下观察细胞超微结构发现，转染对照组细胞显示明显的凋亡改变，转染pCDNA3.1-miR-196a2-T表达质粒组细胞有轻微的凋亡变化，而转染pCDNA3.1-miR-196a2-C表达质粒组无明显的凋亡改变。3.通过生物信息学软件预测出可能与白癜风氧化应激相关的miR-196a2靶基因TRP-1，将其作为miRNA-196a2SNP研究的靶基因。成功构建了TRP-1的报告基因质粒psiCHECK2-TRP-1。双荧光素酶报告系统结果显示，miR-196a2-T和miR-196a2-C均结合靶基因TRP-1，从而抑制荧光素酶的表达，并且miR-196a2-C比miR-196a2-T更加容易和靶基因相结合（P <0.05）。与转染对照组pCDNA3.1质粒黑素细胞相比，pCDNA3.1-miR-196a2-C质粒组黑素合成量显著降低（P<0.01）。H2O2处理后与转染对照组质粒黑素细胞相比，转染pCDNA3.1-miR-196a2-C表达质粒组黑素细胞中ROS水平显著降低（P <0.05）。结论：1.具有miR-196a2CC基因型的个体与TT和TC的联合基因型相比白癜风的发病易感性降低，miR-196a2SNP rs11614913T>C可能降低白癜风易感性。2. H2O2诱导的氧化应激下，miR-196a2SNP rs11614913T>C可减少黑素细胞的早期凋亡率，对黑素细胞凋亡具有保护作用。3. TRP-1是miR-196a2的靶基因，并且miR-196a2-C比miR-196a2-T更加容易和它相结合。miR-196a2SNP rs11614913T>C可能通过结合靶基因TRP-1而降低H2O2处理后的ROS水平，从而保护黑素细胞的损伤。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 1 白癜风概述
• 2 microRNA（miRNA）概述
• 实验一 miR-146a，miR-149，miR-196a2，miR-499 单核苷酸多态性与白癜风的关联性研究
• 1 材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 研究人群及数据采集
• 2.2 调查表的设计及条目定义
• 2.3 血液样本中基因组 DNA 制备及保存
• 2.4 PCR-RFLP 测定基因型
• 2.5 质量控制及统计学分析方法
• 3 结果
• 3.1 研究对象的一般特征
• 3.2 电泳结果和基因型判别
• 3.3 miRNA 位点单核苷酸基因多态性与白癜风易感性的关系
• 4 讨论
• 实验二 miR-196a2 单核苷酸多态性对人黑素细胞损伤保护的细胞生物学研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂
• 1.3 细胞株
• 2 方法
• 2.1 miR-196a2 表达质粒的构建
• 2.2 细胞培养
• 2.3 细胞转染
• 2.4 黑素细胞活性检测
• 2.5 黑素细胞凋亡检测
• 2.6 透射电镜观察不同质粒转染组黑素细胞超微结构变化
• 2.7 统计方法
• 3 结果
• C 对黑素细胞活力无显著影响'>3.1 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 对黑素细胞活力无显著影响
• C 可降低黑素细胞早期凋亡率'>3.2 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 可降低黑素细胞早期凋亡率
• C 对黑素细胞超微结构的影响'>3.3 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 对黑素细胞超微结构的影响
• 4 讨论
• 实验三 miR-196a2 单核苷酸多态性对人黑素细胞损伤保护机制的初步研究
• 1 材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 预测及构建 TRP-13’UTR 报告质粒
• 2.2 细胞培养
• 2.3 细胞转染
• 2.4 荧光素酶报告基因检测
• 2.5 转染细胞的黑素合成含量测定
• 2.6 转染细胞的酪氨酸酶活性测定
• 2.7 转染细胞的 ROS 含量测定
• 3 结果
• C 降低靶基因 TRP-1 的表达'>3.1 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 降低靶基因 TRP-1 的表达
• C 能降低黑素细胞的黑素合成量，而对酪氨酸酶活性没有影响'>3.2 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 能降低黑素细胞的黑素合成量，而对酪氨酸酶活性没有影响
• C 能降低H₂O₂诱导下黑素细胞中 ROS 水平'>3.3 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 能降低H₂O₂诱导下黑素细胞中 ROS 水平
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢