大豆隐花色素基因的酵母双杂交分析

论文摘要

隐花色素（cryptochrome）是吸收蓝光和近紫外光而调节植物形态、新陈代谢变化以及向光反应的一类光敏受体。隐花色素广泛存在于生物界中,研究证明许多植物的隐花色素是分子量为70-80kD的蛋白质,有两个可识别区域:一个是与光解酶有同源序列的N端PHR（photolyase related）,但不具有光解酶的DNA修复活性;另一个是光解酶不具有的C端延伸区,C端是蛋白-蛋白结合区,具有保守性,也是蓝光信号得以向下游传递的延伸区域。蓝光信号转导涉及隐花色素与其他蛋白质间直接或间接的相互作用。目前,许多植物的隐花色素基因已相继被分离和初步鉴定。中国农业科学院作物科学研究所613室克隆了大豆两个隐花色素基因并对其功能作了初步的分析。酵母双杂交是体内研究蛋白质相互作用的新方法。为进一步研究这两个基因的功能及下游信号传导机制,本试验对这两个基因作了酵母双杂交分析。首先用PCR及酶切、连接的方法构建了两个基因的N端、C端及全长的酵母双杂交诱饵载体:pGBKT7-CRY1N、pGBKT7-CRY1C、pGBKT7-CRY1Q、pGBKT7-CRY2N、pGBKT7-CRY2C、pGBKT7-CRY2Q。分别与空的AD载体pGADT7组合转入酵母菌株AH109进行自激活检测,结果表明只有pGBKT7-CRY2N+p pGADT7能激活报告基因的表达,因此重组质粒pGBKT7-CRY2N不能用于酵母双杂交分析。其次,用pGBKT7-CRY1C作为诱饵,筛选了大豆酵母双杂cDNA文库。用醋酸锂转化法将诱饵和文库质粒先后转入酵母菌株AH109后,经SD/-Leu-Trp培养基扩增,然后鉴定转化子对HIS3、ADE2、lacZ三个报告基因的激活情况,初步获得了17个能同时激活三个报告基因的阳性克隆。对阳性克隆进行了PCR和测序分析,序列分析的结果表明其中5个克隆含有正确的读码框,同源性分析表明其中4个是与光系统中基因同源的序列。最后将来源于大肠杆菌这五个克隆的质粒与诱饵质粒pGBKT7-CRY1C组合重新转回酵母细胞AH109中作了进一步的验证,结果表明五个基因与大豆隐花色素基因CRY1的C端有相互作用的可能性,但结果有待于进一步验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物隐花色素研究进展
• 1.1.1 隐花色素的性质
• 1.1.2 隐花色素与光的形态建成
• 1.1.3 隐花色素与其他蛋白质的相互作用
• 1.1.4 其他植物中的隐花色素
• 1.2 酵母双杂交的原理及应用
• 1.2.1 酵母双杂的原理
• 1.2.2 基本组成部分
• 1.2.3 应用
• 1.2.4 酵母双杂系统存在的不足
• 1.2.5 酵母双杂交的发展
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 菌株、质粒及药品等
• 3.2 引物
• 3.3 培养基及缓冲液的配制
• 3.4 研究流程
• 3.4.1 诱饵载体的构建
• 3.4.2 酵母菌株的表型鉴定
• 3.4.3 酵母菌株AH109感受态细胞的制备及载体的转化
• 3.4.4 培养基中3-AT浓度的优化
• 3.4.5 诱饵蛋白的自激活检测
• 3.4.6 大豆酵母双杂交文库的转化及转化效率的计算
• 3.4.7 阳性克隆的筛选
• 3.4.8 β-半乳糖苷酶活性的滤纸分析
• 3.4.9 酵母质粒的提取
• 3.4.10 大肠杆菌DH5α电转感受态细胞的制备
• 3.4.11 大肠杆菌DH5α的质粒电转
• 3.4.12 阳性克隆序列信息的获得及重新转化酵母进行一对一分析
• 4 结果与分析
• 4.1 目的基因片段诱饵载体的构建
• 4.1.1 pGBKT7载体的结构特点
• 4.1.2 目的基因片段的扩增
• 4.1.3 目的基因片段与载体的连接与鉴定
• 4.2 酵母菌株的表型鉴定
• 4.3 培养基中3-AT浓度的优化
• 4.4 诱饵质粒的自激活检测
• 4.5 用pGBKT7-CRY1C作为诱饵筛选文库
• 4.5.1 文库的转化及转化效率的计算
• 4.5.2 阳性克隆的筛选
• 4.6 阳性克隆分析
• 4.6.1 酵母质粒的提取及阳性克隆的PCR分析
• 4.6.2 阳性克隆酵母质粒的电转及序列信息的获得
• 4.6.3 五个阳性克隆分别重新共转化酵母进行一对一分析
• 5 讨论
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢