大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药性研究

论文摘要

背景:喹诺酮类药物是一大类人工合成的抗菌药,自1962首次研制成功第一个喹诺酮类药物—萘啶酸以来,该类药物发展非常迅速。氟喹诺酮类药物是新一代广谱抗菌药,已成为喹诺酮类药物的主流。氟喹诺酮类药物因具有抗菌谱广、抗菌活性强、毒副作用较小、体内分布广、给药方便等优点,已广泛应用于医学和兽医学临床。大肠埃希菌是重要的医院感染病原菌,具有多种复杂的耐药机制。随着氟喹诺酮类药物的普遍使用,尤其是临床不合理用药,造成大肠埃希菌对此类药物的耐药株迅速增多,耐药程度日趋严重。氟喹诺酮类耐药成为临床治疗中的严重问题。大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制成为国内外广泛关注的问题。目前已知大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制有三种:（1）基因突变导致药物作用靶位酶—DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ突变;（2）基因突变导致药物在菌体内的蓄积浓度下降;（3）质粒介导的耐药机制。其中第一种机制是大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制。了解本地区、本单位大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药性现状,深入研究大肠埃希菌耐药性的产生和传播,准确检测耐药表型和基因型,对于控制耐药性的产生和发展及医院感染,合理应用抗菌药物具有重要意义。为此,本课题通过分析临床大肠埃希菌耐药性监测数据,并通过体外诱导实验诱导出高度耐氟喹诺酮类的大肠埃希菌,检测诱导耐药株gyrA和parC基因的喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance determining region,QRDR）内的突变,深入研究大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药性。目的:通过分析临床大肠埃希菌耐药性监测数据,了解临床大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药性特点;通过体外多步法诱导实验,检测诱导前后大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的敏感性及交叉耐药性,检测大肠埃希菌的超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum beta lactamases,ESBLs）及产ESBLs大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的相关耐药,为临床合理使用氟喹诺酮类药物提供指导;通过研究大肠埃希菌Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与其对氟喹诺酮类药物耐药性的关系,了解大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法:用whonet5.4软件统计2008年我院（河南中医学院第一附属医院）临床大肠埃希菌耐药性监测数据。对临床分离到的大肠埃希菌用Phoenix-100全自动细菌鉴定系统将其鉴定到种。用琼脂稀释法测定对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）。依据鉴定和药敏结果选择37株大肠埃希菌作为实验菌株,并编入环丙沙星诱导组（有菌株CE1-CE14共14株）、左氧氟沙星诱导组（有菌株LE1-LE11共11株）、加替沙星诱导组（有菌株GE1-GE12共12株）三个实验组。同时用大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。对实验菌株分别进行多步法环丙沙星诱导性耐药试验（菌株CE1-CE14）、左氧氟沙星诱导性耐药试验（菌株LE1-LE11）和加替沙星诱导性耐药试验（菌株GE1-GE12）。实验步骤如下:用灭菌生理盐水制备1×108CFU/ml的菌悬液,取10μl的菌悬液接种于2ml含1/4MIC抗菌药物浓度的MH肉汤中,使其最终细菌接种量为5×105CFU/ml,35℃培养24h。挑选生长良好的24h细菌培养物,用灭菌生理盐水稀释制备1×108CFU/ml的菌悬液,取10μl的菌悬液接种于2ml含1/2MIC抗菌药物浓度的MH肉汤中,35℃培养24h。如上步骤,通过连续转种培养,药物浓度自1/4MIC开始,逐步提高MH肉汤中药物浓度直至含128倍MIC抗菌药物浓度。将诱导出的耐药菌接种在无抗菌药物的MH肉汤中,35℃培养,每24h转种一次,连续培养5天。用纸片确证试验测定临床分离菌株和实验菌株的ESBLs。对实验菌株用琼脂稀释法测定氟喹诺酮类的MIC;用PCR法扩增gyrA、parC后测定DNA序列。结果:2008年临床共分离菌株223株（排除重复菌株）,其中ESBLs阳性菌株94株（阳性率42.2%）。ESBLs阳性菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐药率分别为87.8%、84.9%、84%,ESBLs阴性菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星的耐药率分别为71.2%、73%、72.3%。环丙沙星诱导组的14株实验菌中有CE1-CE6、CE8-CE12、CE14共12株菌经过不断增加药物浓度的传代培养后诱导出稳定的高耐环丙沙星菌株。环丙沙星对诱导耐药株的MIC为128-512μg/ml,与原株（MIC为0.016-2μg/ml）比较,增加了128-32000倍。左氧氟沙星诱导组的11株实验菌中有LE1、LE2、LE4、LE6、LE8、LE9、LE10共7株菌经过不断增加药物浓度的传代培养后诱导出稳定的高耐左氧氟沙星菌株。左氧氟沙星对诱导耐药株的MIC为128-256μg/ml,与原株（MIC为2-4μg/ml）比较,增加了32-64倍。加替沙星诱导组的12株实验菌中有GE3、GE5、GE8、GE9、GE11共5株菌经过不断增加药物浓度的传代培养后诱导出稳定的高耐加替沙星菌株。加替沙星对诱导耐药株的MIC为128-512μg/ml,与原株（MIC为2-4μg/ml）比较,增加了32-128倍。诱导出的高度耐药株对氟喹诺酮类之间存在交叉耐药性。诱导前后实验菌株的ESBLs结果未改变。产ESBLs的大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物存在相关耐药。对大肠埃希菌ATCC25922、敏感菌CE1及诱导耐药菌株CE1I、CE6I、LE1I、LE2I、LE8I、GE3I、GE5I、GE8I,分别经PCR扩增gyrA和parC。结果全部菌株均在扩增产物的电泳图谱上出现了648bp的gyrA和417bp的parC条带。经过对gyrA和parC基因进行测序。结果8株诱导耐药株的gyrA基因的喹诺酮耐药决定区（QRDR）内的第83位的丝氨酸（TCG）均被亮氨酸（TTG）代替,第87位的天冬氨酸（GAC）均被天冬酰胺（AAC）代替。8株诱导耐药株的parC基因QRDR内的第80位的丝氨酸（AGC）均被异亮氨酸（ATC）代替。大肠埃希菌ATCC25922及敏感菌CE1的gyrA和parC基因QRDR内的氨基酸序列未发生变化。结论:1.在抗菌药物的长期选择性压力下,可使大肠埃希菌产生获得性耐药。2.大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物存在交叉耐药性,且产ESBLs的大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物存在相关耐药。3.DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的改变是大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药的主要机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 正文 大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药性研究
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述 细菌对氟喹诺酮类药物耐药性的研究进展
• 正文
• 参考文献
• 缩写词索引
• 在校期间发表文章
• 致谢