豌豆根瘤菌染色体hxy基因的克隆与功能研究

论文摘要

以往在豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv.viciae）中鉴定出的13个结瘤基因均位于其共生大质粒pRL1JI上,分属5个操纵子（nodO,nodMNT,nodFEL,nodD和nodABCIJ）。其中nodD是控制其它所有结瘤基因操纵子转录的重要调节基因。在研究NodD与结瘤基因启动子之间相互作用的过程中,本实验室新近在豌豆根瘤菌染色体上发现了能够特异地结合结瘤基因启动子DNA的蛋白因子HurL。通过构建豌豆根瘤菌的hurL基因突变株对hurL基因功能进行的研究结果表明hurL基因对豌豆根瘤菌的生长及结瘤有重大影响。同时在对克隆到的含有hurL基因长3096 bp的DNA序列用NCBI Blast分析以及ORF搜索发现:在hurL基因的上游存在一个长1794 bp的不完整的ORF,它编码的多肽的氨基酸序列与Sinorhizobium meliloti中的Lon蛋白酶的C-端部分非常相似;而在hurL基因的下游,也发现存在一个长546bp的不完整的ORF,它编码的多肽的氨基酸序列与Sinorhizobium meliloti中的一个未知功能的跨膜蛋白的N-端部分相似。本论文选取hurL基因的下游hxy基因作为研究对象,并进行了初步研究。首先将已有的hurL基因下游基因hxy的不完整ORF序列进行双酶切反应,回收酶切片断设计探针,与豌豆根瘤菌野生型菌株8401基因组总DNA分别经多种限制性内切酶完全酶切的产物进行Soutern杂交实验,获得了含有该基因完整片段的长约2kb的DNA序列,并且证明了该基因在豌豆根瘤菌染色体上有且只有一个拷贝。进一步以上述的DNA序列为模板,运用GenomeWalking法克隆得到hxy基因区域的2kb大小的DNA片断并进行了测序,序列分析结果表明hxy基因的ORF全长587bp。用NCBI BLAST将该基因与所有已发表的基因序列相比对,没有发现与之具有较好同源性的基因序列,并且Axy基因可能编码的蛋白质序列也没有找到与之相似的蛋白质序列,推测该基因很可能是一个新的基因。为了研究hxy基因的功能,本论文运用同源重组手段将卡那霉素抗性基因插入到野生型豌豆根瘤菌8401pRL1J的hxy基因中,构建了豌豆根瘤菌hxy基因的突变株mutDw6。与野生型相比,该突变株的生长状况并未受到明显影响。通过测定构建的结瘤基因启动子—LacZ报告基因在突变株mutDw6中的转录水平,发现结瘤基因nodD,nodA和nodF的转录也无显著变化,表明hxy基因并不参与豌豆根瘤菌结瘤

论文目录

• 摘要
• 目录
• 1 前言
• 1.1 简介
• 1.2 根瘤菌的分类
• 1.3 结瘤基因的组织和分类
• 1.3.1 结瘤基因的分类
• 1.3.2 结瘤基因的功能及其与nod box和类黄酮分子的相互作用
• 1.3.3 nod box的结构特征
• 1.3.4 NodD与诱导物相互作用的细胞定位
• 1.3.5 NodD与诱导物是否发生直接相互作用
• 1.3.6 诱导物对于NodD与nod box结合的影响
• 1.4 结瘤基因的调控
• 1.4.1 R. leg. 8401（pRL1JI）中结瘤基因的调控
• 1.4.2 B. japonicum中结瘤基因的调控
• 1.4.2.1 two-component调节
• 1.4.2.2 负调控系统
• 1.4.3 Rhizobium sp. NGR234中结瘤基因的调控
• 1.5 结瘤基因表达的精细调控
• 1.5.1 结瘤基因的负反馈调控
• 1.5.2 结瘤基因的quorum调控
• 1.5.2.1 B. japonicum中的quorum调节
• 1.5.2.2 R. leguminosarum bv. Viciae中的quorum感知调节体系
• 1.5.2.3 S. meliloti中的quorum感知调控
• 1.6 前景与展望
• 1.7 关于本研究
• 2.材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 引物、酶和主要生化试剂
• 2.2.1 引物
• 2.2.2 酶和主要生化试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 基本的实验技术和方法
• 2.3.1 细菌培养
• 2.3.2 质粒DNA的抽提
• 2.3.3 感受态细胞制备和重组质粒的转化
• 2.3.3.1 感受态细胞的制备
• 2.3.3.2 重组质粒的转化
• 2.3.4 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA
• 2.4 根瘤菌总DNA的抽提
• 2.4.1 根瘤菌总DNA的小量抽提
• 2.4.2 根瘤菌总DNA的大量抽提
• 2.5 Southern杂交
• 2.5.1 切口平移法标记hxy基因探针
• 2.5.2 将DNA转移到尼龙膜
• 2.5.3 放射性标记的探针与固定于尼龙膜上的DNA进行杂交
• 2.6 豌豆根瘤菌基因组hxy基因的克隆及序列分析
• 2.6.1 豌豆根瘤菌基因组DNA Sal Ⅰ酶切片段接头与接头引物的设计
• 2.6.2 豌豆根瘤菌基因组hxy基因特异引物设计
• 2.6.3 GenomeWalking法克隆hxy基因
• 2.6.4 DNA序列分析及同源性比较
• 2.7 根瘤菌RNA的抽提和RT-PCR反应
• 2.7.1 RNA专用仪器的预处理
• 2.7.2 水饱和酚的配制
• 2.7.3 根瘤菌RNA的抽提
• 2.7.4 RNA的甲醛变性电泳
• 2.7.5 RT-PCR反应
• 2.8 双亲杂交
• 2.9 豌豆根瘤菌hxy突变株的构建
• 2.9.1 含插入了卡那霉素抗性片段的hxy基因的重组质粒的构建
• 2.9.1.1 含卡那霉素抗性基因的DNA片段的制备
• 2.9.1.2 含插入了卡那霉素抗性片段的hxy基因的重组质粒的构建
• 2.9.2 豌豆根瘤菌hxy突变株的构建
• 2.9.3 豌豆根瘤菌hxy基因卡那霉素抗性插入突变菌株的验证
• 2.9.3.1 PCR方法验证
• 2.9.3.2 Southern杂交方法验证
• 2.10 豌豆根瘤菌hxy突变株中结瘤基因表达的测定
• 2.10.1 结瘤基因表达报告质粒的构建
• 2.10.2 根瘤菌电转化感受态细胞的制备
• 2.10.3 利用电转化的方法将报告质粒转移到根瘤菌野生型菌株和hxy突变株中
• 2.10.4 β-半乳糖苷酶活性的测定
• 2.10.4.1 试剂配制
• 2.10.4.2 β-半乳糖苷酶活性测定
• 3.实验结果
• 3.1 豌豆根瘤菌基因组中只含单一种类和单一拷贝的hxy基因
• 3.2 豌豆根瘤菌hxy基因的克隆
• 3.3 豌豆根瘤菌hxy基因的测序及序列分析
• 3.4 豌豆根瘤菌hxy基因序列的同源性比较
• 3.5 豌豆根瘤菌hxy基因RT-PCR结果
• 3.6 豌豆根瘤菌hxy突变株的构建
• 3.7 豌豆根瘤菌hxy突变株mutDw6的鉴定
• 3.8 豌豆根瘤菌hxy基因突变对结瘤基因表达的影响
• 4.讨论
• 4.1 豌豆根瘤菌hxy基因很可能是一个新基因
• 4.2 在转录水平上hxy基因不影响结瘤基因的表达
• 4.3 豌豆根瘤菌hxy基因的功能进一步研究
• 4.3.1 结瘤实验
• 4.3.2 引物延伸实验
• 4.3.3 构建hxy基因表达质粒
• 参考文献
• 致谢