EGFR家族成员在肿瘤细胞辐射抵抗中的作用机制研究

论文摘要

第一部分HER2抑制对辐射诱导的乳腺癌细胞DNA-PK表达和激活的影响【背景和目的】：HER2是EGFR家族成员，在多种肿瘤组织高表达。研究中显示辐射和抗HER2抗体协同的抗瘤效应。其机制被认为是抗HER2抗体阻断了HER2介导的DNA损伤修复，但尚未有直接证据证明HER2与辐射导致的DNA损伤修复相关。因此本研究观察HER2靶向单克隆抗体及RNA干扰技术抑制HER2对辐射后乳腺癌细胞DNA损伤修复的主要激酶DNA-PKcs表达和活性的影响。【方法】：MDA-MB-453细胞为HER2过表达，并且EGFR低表达乳腺癌细胞，首先，通过克隆形成实验检测曲妥珠单抗预处理对MDA-MB-453细胞辐射后生存分数（SF）的影响。然后将细胞设为空白对照组，单纯辐射组，以及曲妥珠单抗预处理组及shRNA预处理组。曲妥珠单抗预处理组在辐射前，在200 mM曲妥珠单抗中作用12h，shRNA预处理组在辐射前通过shRNA转染沉默靶蛋白HER2.然后通过免疫印记检测各组细胞辐射后DSB修复的关键激酶DNA依赖蛋白激酶催化亚单位DNA-PKcs以及其另外两个亚基ku80和ku70蛋白表达和活性的变化，同时通过单细胞中性凝胶（comet assay）电泳分析了曲妥珠单抗对辐射导致DSB的影响。【结果】：曲妥珠单抗预处理后MDA-MB-453各时间点生存分数较空白对照组降低（p＜0.01）。曲妥珠单抗预处理组DSB辐射后80min时较单纯辐射组增加（19.1±3.32，43.5±4.18；p＜0.01），而免疫印记显示曲妥珠单抗预处理组DNA-PKcs蛋白降低，辐射后40min DNA-PKcs蛋白表达量预处理组低于单纯照射组（18.4±5.1，25.4±5.5；p＜0.01），并且ku80及ku70蛋白表达较单纯辐射组低（p＜0.01）。通过shRNA抑制HER2后，DNA-pkcs蛋白表达降低，shRNA预处理组辐射后40min DNA-pkcs表达量均明显低于单纯辐射组（13.5±1.5，24.1±2.6；p＜0.01），但高于空白对照组（p＜0.05）。【结论】：HER2靶向曲妥珠单抗及shRNA能够降低乳腺癌细胞的辐射耐受能力，其可能的分子机制与其抑制DNA-PK活性和蛋白表达导致DSB修复下降有关。第二部分AG825对HER2高表达乳腺癌细胞的辐射耐受的影响【背景和目的】：HER2属于受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase receptor），具有激酶活性，其激酶活性对乳腺癌细胞辐射耐受的作用尚不明确。AG825为HER2受体激酶活性特异性抑制剂，已有研究显示AG825能够抑制肺癌和前列腺癌细胞生长，本部分研究试图通过观察AG825对HER2高表达乳腺癌细胞的辐射增敏作用，探讨HER2激酶活性在辐射抵抗中的作用，并从DNA双链断裂（Double strand break，DSB）损伤修复的角度初步探讨AG825辐射增敏机制。【方法】：首先通过MTT比色法观察了不同浓度AG825对HER2高表达乳腺癌细胞系MDA-MB-453生长抑制作用。然后将细胞设为空白对照组，单纯辐射组，以及AG825预处理组。通过克隆形成实验观察AG825预处理组和单纯辐射组乳腺癌细胞辐射后生存分数（Survivial fraction，SF）的差异。并且通过单细胞中性凝胶电泳分析了AG825预处理对辐射诱导的DSB的影响。同时用免疫印记法分析AG825预处理后MDA-MB-453细胞在辐射后不同时间DSB修复的关键激酶DNA依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）蛋白的表达情况。【结果】：MTT比色法显示AG825对MDA-MB-453生长抑制作用随AG825浓度增高而增加。辐射后单纯放射组MDA-MB-453细胞生存分数较空白对照组明显下降。AG825预处理组辐射后生存分数较单纯放射组进一步下降（p＜0.01），同时DSB增加，辐射后80min预处理组尾距教单纯辐射组增加（43.46±4.18，19.1±3.32；p＜0.01）。免疫印记显示单纯放射组DNA-PKcs蛋白表达在辐射后较空白对照组增加，而AG825预处理组DNA-PKcs表达下降，AG825预处理组辐射后40min DNA-pkcs表达量均明显低于单纯辐射组（8.5±5.0，24.1±2.6；p＜0.01）。【结论】：AG825对HER2高表达乳腺癌细胞具有生长抑制作用。并且其对HER2高表达乳腺癌细胞具有辐射增敏作用，其辐射增敏机制可能与AG825抑制DNA-PKcs蛋白表达而减少辐射后DSB修复有关。但还需进一步的体内实验来评价AG825辐射增敏作用。第三部分辐射诱导乳腺癌细胞HER2核转运【背景与目的】：我们在上一部分中的研究显示HER2抑制可以减少DNA-PK激活，但其具体信号传导途径尚不明确，现有研究显示HER2激活可以活化PI3K／AKT等传统信号通路，而新近的研究显示：HER2转运入细胞核激活相关靶蛋白和靶基因是新近发现的HER2传递信号的新途径，这种途径在肿瘤细胞对辐射的耐受中的作用尚未有研究，故而，本研究试图观察辐射对HER2在细胞内核表达的影响，初步探讨HER2核转运在乳腺癌细胞辐射抵抗当中的作用。【方法】：以HER2高表达乳腺癌细胞MDA-MB-453及SK-BR-3为研究对象，通过荧光共聚焦显象分析辐射后细胞核内外HER2的变化，并通过免疫印记分析辐射后MDA-MB-453以及SK-BR-3细胞核内HER2表达的变化。然后还通过免疫印记分析了顺铂对MDA-MB-453细胞核内HER2表达的影响。并且观察了曲妥珠单抗和AG825对MDA-MB-453辐射后的生存分数的影响，以及曲妥珠单抗和AG825对辐射后乳腺癌细胞核表达的影响。通过荧光共聚焦显象以及免疫沉淀分析了HER2和DNA-pk的相互作用，以及辐射后SK-BR-3细胞内HER2和EGFR之间的相互关系。【结果】：HER2高表达乳腺癌MDA-MB-453及SK-BR-3细胞辐射后，荧光共聚焦显象和免疫印记皆检测到核内HER2受体表达增高，SK-BR-3辐射后20min核内HER2受体表达高于空白对照组（24.1±3.3，2.7±0.2，P＜0.01），MDA-MB-453辐射后20min核内HER2受体表达高于空白对照组（38.5±5.3，2.1±0.3，P＜0.01）。曲妥珠单抗和AG825预处理过的MDA-MB-453细胞生存分数下降，同时AG825及Herceptin预处理后MDA-MB-453细胞ERBB2蛋白核表达量在三个时间点均低于单纯辐射组（P＜0.01）。荧光共聚焦显象显示HER2及DNA-pkcs有明显共定位显象，但免疫共沉淀未检测到二者形成的复合物。【结论】：辐射能够诱导HER2过表达乳腺癌细胞的HER2转运入细胞核，HER2抑制导致的乳腺癌细胞辐射敏感性增高伴有核HER2表达下降，提示HER2核转运可能和辐射抵抗及DNA损伤修复有关。第四部分辐射对宫颈癌细胞EGFR核转运的影响【背景和目的】：EGFR家族成员直接转运入核调节靶蛋白和靶基因的表达和活性是新近发现的EGFR家族传递信号的新途径。我们先前的研究显示辐射能够诱导乳腺癌细胞中HER2转运入细胞核，而EGFR家族另一成员EGFR与宫颈癌放疗后复发的密切关系，故而进一步研究了辐射对宫颈癌肿瘤细胞EGFR核转运的影响，并探讨EGFR核转运在宫颈癌细胞辐射耐受中可能的作用。【方法】：首先通过免疫印记分析了EGFR在宫颈腺癌细胞Hela和Siha以及宫颈鳞癌细胞Caski中的表达。将EGFR高表达的Caski细胞分为辐射组和空白对照组，X线照射4Gy后将Caski细胞浆和细胞核分离，采用免疫印记检测Caski细胞核内EGFR和细胞浆内EGFR不同时间点的表达变化。并且分析了西妥昔单抗（C225）对辐射诱导的Caski细胞EGFR核表达影响及其生存分数的影响。【结果】：免疫印记显示三株宫颈癌细胞中Caski细胞系EGFR呈高表达。辐射后，免疫印记检测到辐射组Caski细胞核内EGFR受体表达高于对照组（P＜0.01），并且随时间增多，辐射后4Gy后10min、20min后Caski细胞核内EGFR表达量较0min增高，差异有统计学意义（F=21.98，P＜0.01）、（F=30.35，P＜0.01），而胞浆内EGFR受体较对照组减少，并呈时间依赖性，辐射后4Gy后10min、20min后Caski细胞浆内EGFR表达量较0min减少，差异有统计学意义（F=7.49，P＜0.05；F=8.96，P＜0.05）。C225预处理后，Caski细胞的EGFR核表达辐射后明显降低。C225预处理后Caski细胞EGFR蛋白核表达量在辐射4Gy后10min和20min均低于单纯辐射组（F=46.6，P＜0.01；F=68.8，P＜0.01）。【结论】：宫颈癌Caski细胞受到辐射后细胞核EGFR增多而胞浆内EGFR减少显示辐射能够诱导宫颈癌细胞EGFR核转运，并且C225导致的宫颈癌细胞生存分数下降伴有核内EGFR表达下降，提示EGFR核表达可能和辐射抵抗相关，但核内EGFR在宫颈癌细胞辐射抵抗中的作用尚需进一步研究。

论文目录

• 缩略词及中英文对照
• 前言
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 HER2抑制对辐射诱导的乳腺癌细胞DNA-PK表达和激活的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 AG825对乳腺癌细胞的辐射增敏作用
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 辐射诱导乳腺癌细胞HER2核转运
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四部分 辐射对宫颈癌细胞EGFR核转运的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 综述 核转运:EGFR受体家族传递信号的新途径
• 参考文献
• 附录
• 致谢