茶树叶部由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶及咖啡碱合成相关酶基因差异表达

论文摘要

茶树叶片中的单萜烯醇和芳香族醇等挥发性组分主要是以糖苷形式存在，且以樱草糖苷和葡萄糖苷为主。与这类糖苷的合成与水解相关的酶类主要有β-樱草糖苷酶、β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶Ⅰ、β-葡萄糖苷酶Ⅱ和β-葡萄糖基转移酶。糖苷水解释放出的挥发性苷元，不仅是茶叶香气的物质基础，更参与茶树对病虫害的防御反应。研究茶树叶片中由病原真菌侵染引发的内源糖苷酶基因表达差异，将开阔我们认识茶树与环境关系的新视野，为进一步揭示茶树抗病性机理提供依据，也为改善茶叶香气品质提供理论基础。咖啡碱作为茶叶中嘌呤类生物碱的主体成分，因其具有重要的药理作用而一直被人们关注。然而咖啡碱与茶树生理抗性方面的研究却鲜有报道。现已有研究表明，咖啡碱作为一种有效的抑菌物质，能有效抑制茶树常见致病菌的生长，可能参与茶树抵抗病菌侵染的防御反应。研究真菌侵染下茶树叶片中咖啡碱合成相关酶基因表达差异，有利于探明咖啡碱抑菌机理，进一步丰富茶树抗病性理论。本文利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，选用GAPDH为参照基因，研究了真菌侵染前后茶树叶片内源糖苷酶基因和咖啡碱合成相关酶基因的表达水平差异，以及利用高效液相色谱法检测了真菌侵染后不同阶段茶树叶片中咖啡碱含量的变化。主要结果如下：内源糖苷酶的实时定量PCR结果表明，β-樱草糖苷酶、β-葡萄糖苷酶Ⅰ、β-葡萄糖苷酶Ⅱ、β-葡萄糖基转移酶的表达水平在供试的3个茶树品种中变化趋势基本一致，均有不同程度的诱导上调。这些关键酶基因的表达上调可能预示着更多糖苷类香气前体的积累和更大量挥发性苷元的释放，可能对增强茶树抗病性有一定的帮助。基因的诱导上调多发生在染病初期，也提示轻度侵染可能刺激茶叶糖苷类香气前体的积累和挥发性苷元的释放。咖啡碱合成相关酶的实时定量PCR结果表明，TCS1、sAMS、TIDH在3个供试茶树品种中的表达趋势基本一致，TCS1上调幅度显著，sAMS上调较为明显，TIDH则无明显上调变化。TCS1基因在咖啡碱生物合成途径中负责后两步甲基化，即催化7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱这两步甲基化反应，sAMS则是活化甲硫氨酸为腺苷甲硫氨酸，为甲基化反应提供甲基来源，这些关键酶基因的表达水平上调，预示着咖啡碱生物合成增加的可能性。咖啡碱液相检测结果表明，舒茶早、多抗香2个品种中咖啡碱含量有相似起伏变化，均表现为在染病初期先降低，中期增加，后期又降低的趋势。没有发现基因水平上表达差异与生化水平上含量变化的一致性，分析原因可能是，从基因表达到咖啡碱相关酶的活性变化，再到咖啡碱生物合成，需要一系列复杂的过程。咖啡碱最终含量是茶树代谢过程中多种因素综合影响的结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 茶树中糖苷类物质研究进展
• 1.2 茶树内源糖苷酶研究概况
• 1.3 糖苷类物质在茶树防御体系中的作用
• 1.4 咖啡碱抑菌作用及其生物合成关键酶研究进展
• 1.5 实时定量 PCR 技术研究进展及应用
• 1.5.1 实时定量 PCR 原理及特点
• 1.5.2 实时定量 PCR 定量方法
• 1.5.3 实时定量 PCR 中内参基因的选择
• 2 引言
• 2.1 研究目的及意义
• 2.2 研究内容
• 2.3 课题来源
• 3 试验材料及方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 试剂及仪器
• 3.2.1 主要仪器设备
• 3.2.2 试剂
• 3.3 方法
• 3.3.1 茶树叶部病原真菌的分离与培养
• 3.3.2 室内对茶树叶片的人工感病处理
• 3.3.3 茶鲜叶中总 RNA 的提取与检测
• 3.3.3.1 总 RNA 的提取
• 3.3.3.2 总 RNA 质量的检测
• 3.3.4 cDNA 第一链的合成
• 3.3.5 目标基因扩增引物的设计与合成
• 3.3.6 目的基因和内参基因的普通 PCR 扩增
• 3.3.7 目的基因和内参基因的实时荧光定量 PCR
• 3.3.8 茶树病叶及健叶中咖啡碱含量的 HPLC 检测
• 3.3.8.1 样品中咖啡碱的提取
• 3.3.8.2 咖啡碱标准曲线的制作
• 3.3.8.3 样品中咖啡碱含量的 HPLC 测定
• 4 结果与分析
• 4.1 室内人工侵染茶树叶片的方法尝试
• 4.2 目的基因及内参基因标准曲线的制备
• 4.2.1 RNA 样品质量检测
• 4.2.2 目的基因及内参基因的标准曲线
• 4.3 茶树叶片内源糖苷酶基因表达的实时定量 PCR 分析
• 4.4 茶树叶片咖啡碱合成相关酶基因表达的实时定量 PCR 分析
• 4.5 茶树叶片中咖啡碱含量的液相测定结果
• 5 讨论
• 5.1 真菌侵染对茶树叶片内源糖苷酶基因表达水平的影响
• 5.2 真菌侵染对茶树叶片咖啡碱合成相关酶基因表达水平及咖啡碱含量的影响
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介