论文摘要
大青叶是十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶,本文以其为研究对象,对大青叶药材的化学成分、质量控制方法和主要有效成分靛玉红的药物动力学进行研究。采用各种色谱技术从大青叶70%乙醇提取物中分离得到了18个化合物,根据理化反应和光谱、波谱数据鉴定了15个。其中1个新化合物:异荭草苷-3”-O-吡喃葡萄糖苷;6个菘蓝属内首分化合物:异荭草苷,异牡荆素-6”-O-吡喃葡萄糖苷,肥皂草苷,loliolide,焦脱镁叶绿酸α乙酯,焦脱镁叶绿酸α甲酯;3个首次从菘蓝中分得:异金雀花素,异金雀花素-3”-O-吡喃葡萄糖苷,异牡荆素-3”-O-吡喃葡萄糖苷。采用二级质谱法对大青叶中分得的黄酮苷质谱裂解规律进行了研究。其中异金雀花素-3”-O-吡喃葡萄糖苷、异牡荆素-3”-O-吡喃葡萄糖苷和异荭草苷-3”-O-吡喃葡萄糖苷3个6-C-葡萄糖基（1→3）-葡萄糖苷主要的碎片离子是[M-H-90]-、[M-H-180]-、[M-H-270]-;异金雀花素、异牡荆素和异荭草苷3个6-C单糖苷主要的碎片离子是碳苷黄酮特征碎片离子[M-H-90]-（[Ag+71]-）和[M-H-120]-（[Ag+41]-）;异牡荆素-6”-O-吡喃葡萄糖苷是6-C-葡萄糖（1→6）-葡萄糖苷,其主要的碎片离子是[Ag+71]-和[Ag+41]-,以及少量的[M-H-90]-和[M-H-120]-;肥皂草苷是6-C-葡萄糖-7-O-葡萄糖混合苷,其主要碎片离子为碳苷黄酮特征的[M-H-90]-和[M-H-120]-离子。采用超高效液相色谱与二极管阵列检测器串联质谱检测器法（UPLC-PDA-MS）,对不同产地的大青叶药材指纹图谱进行研究。采用Acquity UPLC BEH C18柱,0.1%甲酸水-甲醇系统梯度洗脱,PDA串联质谱检测。利用对照品对照、文献对照和提取准分子离子及在线紫外吸收光谱等方法,指认了21个指纹峰。以夹角余弦、相关系数为测度对不同产地药材进行评价,结果表明不同产地的大青叶指纹图谱差异很大。利用紫外、正离子和负离子TIC指纹图谱,比较了同一株菘蓝植物根和叶,即板蓝根与大青叶化学成分的区别,发现叶与根中的黄酮类和生物碱类成分都存在差异。还比较了药典收载正品大青叶与蓼大青叶和路边青叶化学成分指纹图谱的区别,仅在三种植物的叶中提取到少数几个共有峰,表明虽然三者都曾在历史上作大青叶用,其化学成分完全不同。采用液体稀释法,以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白假丝酵母菌作为实验菌,考察了大青叶水提取液和不同浓度醇提液的抑菌活性。结果表明大青叶提取物对金黄色葡萄球菌具有很强的抑制活性,其中以50%乙醇提取物的作用最强;对大肠杆菌和白假丝酵母菌有一定的抑制作用。测定了不同产地大青叶药材的50%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）值,并以该值作为活性指标,与指纹图谱进行相关性研究,结果得到了16个非常显著正相关峰,13个显著正相关峰,呈现正相关的峰大多为黄酮类化合物,提示黄酮类化合物是大青叶中的一个抑菌活性成分群。黄酮类化合物和核苷类化合物属于大青叶中主要的两类化合物。本文采用多反应监测（MRM）超高效液相色谱-质谱/质谱联用法（UPLC-MS/MS）,建立了大青叶中6种黄酮苷的含量测定方法,采用HPLC-UV法建立了大青叶中5种核苷类成分的含量测定方法,并用于不同产地大青叶中黄酮类和核苷类化合物的含量测定,结果表明不同产地批号大青叶药材中这两类有效成分含量差异较大。所建立的分析方法专属、准确、灵敏、高效,为大青叶药材的质量评价提供了新的方法。采用毛细管气相色谱法建立了大青叶挥发油的GC指纹图谱。采用DB-1毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）程序升温,FID检测器测定不同产地大青叶药材的挥发油指纹图谱,采用系统聚类分析对药材分类。结果表明不同产地大青叶中挥发油成分差异比较大,按照其挥发油指纹图谱可以按产地将药材分成不同的类。采用气相色谱/质谱联用法对大青叶挥发油进行分析,鉴定了48个指纹峰。所建立的挥发油指纹图谱为大青叶药材质量评价提供了参考。靛玉红是大青叶中主要的有效成分,具有包括抗肿瘤在内的多种药理活性。本文以靛玉红为研究对象,对其在大鼠体内的药物动力学进行了研究。①建立了大鼠血浆中靛玉红的HPLC-UV分析方法,以蛇床子素为内标,采用液液萃取法作为血浆样品预处理方法,检测波长289nm,流动相为甲醇-水（75∶25）。靛玉红在6.5～1950ng/mL范围内线性关系良好,方法的定量下限为6.5ng/mL,日内精密度RSD≤4.1%,日间精密度RSD≤9.1%,RE在-2.9%～4.4%之间。利用所建立的HPLC-UV法对大鼠尾静脉和腹腔给与靛玉红的药动学进行研究,大鼠静脉给药两个剂量组的Cmax分别为201ng·mL-1、155ng·mL-1,药时曲线下面积AUC0-∞分别为308ng·h·mL-1、130 ng·h·mL-1,表观消除速率常数Ke分别为为0.670 h-1、0.683 h-1,消除半衰期t1/2都约为1h。大鼠尾静脉注射给药后的Cmax为20.8ng·mL-1。Tmax为0.010h,药时曲线曲线下面积AUC0-∞为25.9ng·h·mL-1,表观消除速率常数Ke为0.640 h-1,消除半衰期t1/2为1.08h。大鼠腹腔注射给药的绝对生物利用度是8.4%。②建立了大鼠血浆中靛玉红的UPLC-MS/MS分析方法,采用电喷雾离子源负离子检测模式,选择离子监测261→157和217两个子离子,液液萃取法制备血浆样品后进样分析。靛玉红在125～200 ng/mL范围内线性关系良好,方法的定量下限为1.25ng/mL,日内精密度RSD＜4.8%,日间精密度RSD＜10.8%,准确度RE%在-4.2%～5.6%之间。利用所建立的方法对大鼠灌胃给予靛玉红的药动学进行研究,给药后Cmax为4.69ng·mL-1,Tmax为0.333h,表观消除速率常数Ke为0.425h-1,消除半衰期t1/2为1.63h,药时曲线下面积AUC0-∞为7.30ng·h·mL-1。结果表明,靛玉红血管外给药的生物利用度非常低,血浆消除速度比较快。本研究综合运用多学科专业知识和多种分析手段,研究了大青叶药材的化学成分,建立了基于超高效液相和气相色谱的大青叶质量控制方法,考察了大青叶抑菌活性,探讨了主要活性成分靛玉红的药物动力学过程,为大青叶药材的药效物质基础研究、质量控制和开发利用做了有意义的探索。
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