白僵菌与引诱剂联合控制松褐天牛及白僵菌分子生态学研究

论文摘要

由松材线虫引起的松树萎焉病（Pine wilt disease）已成为我国南方松林最严重的森林病害,给林业生产和生态环境带来了巨大的损失。该病主要借助羽化后的松褐天牛成虫于补充营养和产卵时进行传播。因此,有效地控制松褐天牛的发生,是防治松树萎焉病的关键。由于松褐天牛危害的隐蔽性,化学防治一般难于奏效。因此,利用生物防治和信号化合物引诱方法成为防治松褐天牛的关键措施。然而,这两种方法在利用过程中存在着各自的局限。虽然球孢白僵菌是松褐天牛最重要的病原真菌,在自然界中对天牛也有着非常高的寄生率,但是防治效果不稳定、控制害虫需要较长的时间、单独使用效果往往不佳。人们对白僵菌在自然界的流行动态知之甚少。具有诱集作用的引诱剂已在松褐天牛种群监测和防治中发挥了重要作用,但目前的引诱剂对补充营养期天牛活性较低。为此,在开发松褐天牛补充营养期引诱剂的基础上,为了充分发挥真菌杀虫剂的持续控制作用和引诱剂的引诱聚集作用,我们开展了应用引诱剂与白僵菌联合使用持续控制松褐天牛的研究。本论文还在筛选鉴定白僵菌新型分子标记的基础上,通过野外调查与室内分子分析相结合,借助于群落生态学和分子生态学的理论和方法,系统科学地评价人为引种白僵菌后的环境宿存能力、安全性和将松褐天牛持续控制在低虫口的生态学效应和作用机制。为了开展这项研究,本论文从以下几个方面入手并获得了相应的结果:第一,应用扫描电镜对松褐天牛的触角感器进行扫描观察表明:松褐天牛触角上共有7种感器,即毛形感器、锥形感器、指形感器、棒形感器、瓶形感器、芽形感器以及刺形感器,其中以毛形和锥形感器的数量最丰富。天牛触角对松树主要挥发物的电生理反应表明:松褐天牛成虫触角端部对α-Pinene （500 mg/ml）的EAG （electroantennographic）反应最强（2.3951±0.26 mV）。不同化合物的EAG反应表明:雌、雄成虫对Carene、（+）-α-Pinene、（-）-β-Pinene、Limonene均有较强的EAG反应,与对照（正已烷或空气）有显著性差异。其中,雄成虫对Carene的EAG反应最为强烈,雌成虫对（+）-α-Pinene的EAG反应最强,与其它化合物差异显著。剂量反应测试表明,当α-Pinene浓度在0.0005 mg/ml以下时,EAG反应值没有明显差异,当剂量超过5.0 mg/ml时,EAG反应值随剂量的增加呈直线快速上升趋势。不同化合物组合对松褐天牛的EAG反应表明:松褐天牛成虫触角对（-）α-Pinene + Carene、（-）α-Pinene + （+）-α-Pinene和（-）-α-Pinene + Limone三种二元混合物的EAG反应强烈,而对其余3种二元化合物和松节油的EAG值相对较低,且与单一组分（-）-α-Pinene的EAG值差异不显著。第二,4年林间诱捕结果表明:根据电生理反应所研制的不同引诱剂对松褐天牛都有一定程度的引诱效果,并对其它鞘翅目和半翅目昆虫也有引诱作用。其中,引诱剂Ma02的引诱活性最强,引诱活性显著高于其它8种引诱剂,Ma02诱捕量达到67.6-77.0头/诱捕器,天牛雌雄比为53.26,捕获到的雌成虫的怀卵率仅为61.43%,而引诱剂Ma99-1、Ma03和Ma04怀卵率分别高达100%、96%和96.67%。此外,Ma02诱捕到的雌天牛携带线虫率高达34.8%,雄成虫携带线虫率为25.0%。有效活性距离试验表明,Ma02的有效引诱活性距离至少达到50m,其有效诱捕范围可达0.78公顷。以上结果表明,Ma02不仅具有较高的引诱活性,而且能诱捕到携带线虫并处于补充营养期的天牛成虫。此外,还筛选出了持续引诱周期长达38天的引诱剂缓释器。不同剂量诱捕效果表明,当诱剂达到120 ml/诱捕器时,引诱效果显著增加。自主设计的宣州诱捕器引诱效果显著高于日式诱捕器,分别为36.4头/诱捕器和9.7头/诱捕器。第三,引诱剂与病原菌的联合使用。在松褐天牛幼虫毒力测定的基础上,通过选用不同来源的球孢白僵菌对成虫进行毒力生物测定,最终筛选出高毒力的白僵菌菌株Bb202-1,其校正死率达到86.9%,侵染率为75%。为了比较引诱剂与无纺布菌条不同联合应用方式的控制效果,共设置了5种不同的处理:不放菌区（对照区）、无纺布菌条区、无纺布菌条+引诱剂缓释器联用区、无纺布菌条+诱木联用区和无纺布菌条+引诱剂缓释器+诱木联用区。天牛种群动态监测表明,后两种联合防治区（诱木+无纺布菌条和引诱剂缓释器+诱木+无纺布菌条）对松褐天牛的种群均具有显著的控制作用,虫口密度下降近50%。死树率统计表明,2004年和2005年后两种联合防治区内死树下降率均显著地高于其它防治区（p<0.01）, 2004年死树下降率分别达到65.66%和70.56%,2005年两区均无死树发生,死树下降率达到100%,具有明显的控制效果,但两处理间无显著性差异（p>0.05）。无纺布菌条区和无纺布菌条+引诱剂缓释器联用区的防治效果也显著高于对照区（p<0.05）,2005年两处理区的死树下降率达到83.33%和76.67%,但两处理间也无显著性差异（p>0.05）。放菌后不同时间从非防治区引入松褐天牛至不同防治处理区进行罩笼饲养,结果表明:所有放菌区内的天牛感染率均与对照区有显著差异（p<0.01）,放菌2天后引入第2、3、4、5处理区的天牛感染率在53.33-63.33%,而对照区仅为3.33%;12天后引入的天牛在4个防治区的感染率在30%-40%,对照区感染率为6.67%;22天后引入的天牛感染率为25-35%,对照区感染率为5%。放菌后不同时间对第1、3、4三种处理区内捕捉到的天牛进行罩笼饲养,放菌2天后从第3、4处理区捕捉到的天牛感染率分别为50%和60%,12天后感染率分别为25%和35%,22天后感染率分别为20%和25%。笼内木段上的侵入孔数和幼虫数统计表明:3、4联合防治区诱集天牛罩笼饲养后,木段内的侵入孔数和幼虫数显著低于对照区,其中侵入孔抑制率达到50.02%-54.41%,木段内幼虫数下降率达到25.9%-41.02%。以上结果表明:诱木和无纺布菌条联合应用在防治松褐天牛过程中表现出明显的优势,充分发挥了引诱剂和白僵菌各自的优良特性,实现了优势互补,为持续控制松褐天牛提供了新方法。第四,白僵菌的分子生态学研究。通过选用33个ISSR引物对39株不同来源的白僵菌的种群结构和遗传多样性研究表明:筛选出的18个ISSR引物扩增结果具有高度的多态性和可重复性,在种间和种内不同菌株间具有较高的遗传多样性。18个ISSR引物在39株白僵菌中共扩增出168条带,平均每个引物扩增出9.3个条带,多态性条带有161条,占总条带的95.8%,其中7条是布氏白僵菌Bbr06所特有,14条为多形白僵菌Ba08特有,18条带为粘孢白僵菌Bv01所特有。在36株球孢白僵菌种群内,共扩增出123条带,其中102条（占82.9%）具有多态性,平均每个引物扩增出8.9 （1-13）条带。供试的球孢白僵菌种内遗传相似性系数为0.651-0.972,3种白僵菌种间遗传相似性系数为0.411-0.720,系统聚类结果表明ISSR分子标记能较好地区分形态上相近的3种白僵菌。运用“磁珠富集法”构建了球孢白僵菌Bb202-1的（CA）n、（CT）n、（AAT）n和（ATG）n 4个微卫星富集文库,共得到429个阳性克隆。其中（CA）12探针富集得到的文库中含有177个克隆,（CT）12文库108个克隆,（AAT）10文库72个克隆,（ATG）10文库72个克隆。其中,（CA）12和（CT）12文库阳性率分别高达98%和92.7%,（AAT）10和（ATG）10文库阳性率较低,分别为29.2%和47.2%。通过对165个阳性克隆进行测序后,共得到65个两侧可设计引物的微卫星DNA非冗余序列,富集效率高达39.39%。其中完全型54个,高达83.07%;不完全型或复合型11个,仅占16.93%。65个微卫星中,含有（CA/GT）n和（CT/GA）n类型的分别为20和22个,以（ATG/TAC）n为重复单位的有4个,没有获得（CGC）n类型的微卫星DNA。还获得了1个（A）45、2个（CGC）6、1个（CTCCT）9和1个（CCTCTT）5等模式的微卫星DNA。通过引物设计,PCR产物电泳检测表明,52对SSR引物能扩增出特异的产物,占80%,其中的44对引物的PCR产物经PAGE检测具有多态性,占67.69%,其中的27对具有高度的多态性,占41.54%。5种不同处理区内的土壤带菌量动态检测表明:4个放菌区的带菌量在放菌后的不同时间内明显高于不放菌的对照区,表明释放菌株在土壤中具有较强的宿存能力。白僵菌寄主昆虫群落和当地虫生真菌群落动态研究表明:白僵菌具有丰富的寄主多样性,寄主的丰度为33种,多度为311株,相对多度高达60.04%。但人工接种式放菌后,寄主昆虫多样性指数和虫生真菌群落多样指数均较为稳定,并没有对寄主昆虫群落和虫生菌群落构成威胁,放菌后的第二年多样性指数反而有上升的趋势。通过对释放菌株与放菌前采集的野生菌的基因型比较分析,从27个SSR标记中获得了2个释放菌株特异的SSR标记。通过对放菌后回收菌株的基因型分析,表明释放菌株在土壤和僵虫中均具有较高的回收率。其中,土壤中释放菌株的回收率在16.67%-66.66%之间波动;僵虫中释放菌株的回收率相对较低,在7.69%-82.14%之间,表明释放菌株已在林间宿存和延续。群体遗传多样性分析表明,释放菌株也没有对土壤和僵虫中的白僵菌种群遗传结构造成不良影响。对释放菌株追踪和寄主谱分析表明,释放菌株虽然能感染林间其它19种非目标寄主昆虫,松茸毒蛾、松褐天牛、马尾松角胫象和黑蚁是释放菌株在林间不同时间内实现寄主转移的关键物种,在食物链的传递中处于重要的地位,为维持林间带菌量和保持遗传稳定性提供了保证。因此,释放菌株通过在土壤中营腐生生活,在不同寄主昆虫间通过寄主转移进行宿存和延续,从而达到持续控制害虫的目的,这也正是真菌杀虫剂发挥生态学效应和持续控制的机制所在。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

第一节虫生真菌的分子生态学和致病分子机理的研究进展

1.1 虫生真菌的分子生态学研究

1.1.1 研究虫生真菌的主要分子标记种类及其在分子遗传多样性上的应用

1.1.2 菌株的亲缘关系与生态背景的相关性

1.1.3 释放菌株的动态监测

1.1.4 持续控制害虫的生态安全性

1.2 虫生真菌侵染寄主昆虫的分子机理

1.2.1 附着胞的形成与诱导

1.2.2 体壁降解蛋白酶及其作用

1.2.3 毒素种类及其作用

1.2.4 寄主昆虫的免疫反应

1.3 基因工程

1.4 展望

第二节松褐天牛病原微生物的研究进展

2.1 天敌微生物的种类组成

2.2 病原真菌对松褐天牛的致病力及应用策略

2.2.1 主要病原真菌对松褐天牛的致病力

2.2.2 主要病原真菌对松褐天牛的控制策略和效果评价

2.3 其它病原微生物对松褐天牛的控制作用

2.4 展望

第二章松褐天牛与寄主松树间的化学通讯及高效引诱剂的研制

第一节松褐天牛触角感器电镜扫描及其对松树挥发物的电生理反应

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试虫源

2.2 气味化合物

2.3 触角电位仪

2.4 触角感器电镜扫描观察

2.5 触角电位反应测定

3 结果与分析

3.1 触角的形态特征

3.2 感器类型与分布特点

3.3 触角不同部位的EAG反应

3.4 不同剂量的EAG反应

3.5 不同化合物的EAG反应

3.6 混合物的EAG反应

4 讨论

第二节松褐天牛高活性引诱剂筛选及其配套技术的研究

1 引言

2 材料和方法

2.1 试验地概况

2.2 供试引诱剂

2.3 引诱剂缓释器

2.4 不同缓释量的诱捕效果

2.5 诱捕器

2.6 诱捕器设置

3 结果与分析

3.1 松褐天牛的种群数量动态

3.2 不同引诱剂缓释器的引诱效果

3.3 不同缓释量引诱剂缓释器的诱捕效果

3.4 不同诱捕器的引诱效果

3.5 不同引诱剂的引诱活性比较

3.6 引诱剂MAO2 的有效活性距离

4 讨论

第三章白僵菌无纺布菌条与引诱剂联合控制松褐天牛的研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 菌种

2.2 培养基

2.3 高毒力菌株筛选

2.4 无纺布菌条的制作

2.5 引诱剂

2.6 引诱剂与无纺布菌条联合防治松褐天牛试验

2.7 不同联合应用防治效果的综合评价

2.7.1 放菌后不同时间林间感染率变化

2.7.2 幼虫感染率

2.7.3 不同防治区死树率调查

2.8 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 松褐天牛成虫高毒力病原真菌筛选

3.2 不同防治方法不同时间内对引入天牛的致病力效果比较

3.3 不同联合防治方法对诱集天牛的致病力比较

3.4 不同联合防治处理区内松褐天牛种群动态变化

3.5 不同防治处理对林间死树率的影响

4 讨论

第四章球孢白僵菌分子标记的开发

第一节球孢白僵菌ISSR分子标记的筛选及其在遗传多样性中的应用

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试菌株及其来源

2.2 试剂配制

2.3 DNA提取

2.4 ISSR引物筛选

2.5 数据分析

3 结果与分析

3.1 ISSR引物扩增效果评价

3.2 遗传亲缘关系和聚类分析

4. 讨论

第二节球孢白僵菌微卫星DNA的分离与鉴定

1 引言

2 材料与方法

2.1 菌株

2.2 菌体制备和DNA提取

2.3 BB202-1 微卫星DNA分离

2.4 微卫星文库构建

2.5 测序和引物设计

2.6 引物特异性PCR验证

2.7 PAGE多态性检测

3 结果与分析

3.1 基因组酶切及产物回收

3.2 连接产物PCR验证

3.3 微卫星富集文库构建

3.4 文库筛选及测序

3.5 微卫星多态性分析

4 讨论

第五章白僵菌持续控制松褐天牛的生态学效应和分子生态学研究

第一节球孢白僵菌林间动态及群落多样性研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 培养基

2.2 僵虫采集

2.3 林间土壤中球孢白僵菌数量动态监测

2.4 群落多样性研究

3 结果与分析

3.1 林间土壤中白僵菌种群数量动态

3.2 林间虫生真菌群落结构与寄主多样性

3.3 人工释放菌株对白僵菌寄主生物多样性的影响

3.4 人工释放菌株对当地虫生真菌群落多样性的影响

4 讨论

第二节球孢白僵菌分子生态学研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试菌株

2.2 菌株培养及DNA提取

2.3 基因型分析（GENOTYPING）

2.4 释放菌株BB202-1 特异分子标记的筛选

2.5 人工释放菌株的宿存动态

2.6 释放菌株对当地白僵菌种群遗传结构的影响

2.7 释放菌株对非靶标昆虫的影响

2.8 数据统计分析

3 结果与分析

3.1 释放菌株BB202-1 特异分子标记的筛选

3.2 人工释放菌株的回收动态分析

3.3 释放菌株对当地白僵菌种群遗传结构的影响

3.4 人工释放菌株的寄主谱动态分析

4 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

白僵菌与引诱剂联合控制松褐天牛及白僵菌分子生态学研究

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