论文摘要
背景和目的猪苓多糖（Polyporus polysaccharides,PPS）是中药多孔菌科真菌猪苓中提取的物质,已有研究表明,其能提高机体免疫力,具有抗肿瘤作用。树突状细胞（Dendritic cell,DC）是目前已知功能最强大的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell,APC）,参与抗原的摄取、加工与提呈,是机体初次免疫应答的始动者,在机体抗肿瘤免疫调节中起重要作用。其膜表面高表达MHC分子及多种共刺激分子和黏附分子,有效激活初始T细胞;它能有效呈递抗原到MHCⅠ和Ⅱ分子上,在相同微环境中使辅助性T细胞或杀伤性T细胞成簇,有助于细胞毒性T淋巴细胞反应（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）。以往有研究表明肿瘤患者机体中DC功能低下;肿瘤微环境中浸润性树突状细胞数量与肿瘤患者预后成正相关,瘤组织中DC浸润多则预后好。研究中药抗肿瘤免疫学机制是否参与影响机体DC细胞增殖、成熟、表型及功能改变,为近年来中药抗肿瘤免疫学探索提供了新的思路。本实验通过观察猪苓多糖对荷H22肝癌小鼠骨髓来源DC的增殖、分化发育、表面标志、抗原提呈功能的影响及对荷瘤小鼠的免疫作用,探讨猪苓多糖的抗肿瘤效应,为进一步阐明猪苓多糖的免疫学活性提供依据。实验方法1.制备荷H22肝癌小鼠。2.体外干预对DC的影响:昆明小鼠右腋下荷瘤,喂养10d后拉颈处死,无菌取骨髓细胞,应用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞生成DC,同时培养液中加入不同浓度猪苓多糖（1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml）使其与DC共培养,并设生理盐水（normal saline,NS）对照组,于第5d加冻融抗原冲击,培养至第8 d收集各组DC。通过倒置显微镜观察DC的形态变化;应用流式细胞仪检测技术检测其表面标志CD11a、CD86表达情况;用MTT法检测DC激活的T细胞对H22肝癌细胞的杀伤效应。按上述方法无菌取荷瘤小鼠骨髓细胞,应用rmGM-CSF和rmIL-4体外诱导骨髓细胞生成DC,同时培养液中加入不同浓度猪苓多糖（1μg/ml,5μg/ml,10gg/ml）使其与DC共培养,设生理盐水对照组,第5d不加冻融抗原,培养8d检测DC增殖周期。3.猪苓多糖体内干预对荷瘤小鼠的影响:昆明小鼠右腋下荷瘤,24h后应用不同浓度的猪苓多糖（20μg、200μg、2000μg）左下腹腔注射,并设生理盐水对照组,连续注药10d后于第11d拉颈处死各组小鼠,分别计算其脾指数和胸腺指数,观察猪苓多糖对免疫功能的影响;通过测定肿瘤抑制率观察其抗肿瘤效应。采用统计软件包SPSS10.0进行统计学分析,结果用（?）±s表示,多个样本均数之间采用单因素方差分析（One-way analysis of variance,One-way ANOVA）,显著性水准为p＜0.05。实验结果1.本实验应用荷瘤小鼠骨髓来源的DC,体外培养加入猪苓多糖。经冻融抗原冲击后,DC表面分子CD86、CD11a表达增高（加药组与生理盐水对照组相比,差异有显著性,p＜0.05）;DC诱导的CTL对H22肝癌细胞杀伤活性增加（加药组与生理盐水对照组相比,差异有显著性,p＜0.05）。未经冻融抗原冲击的DC其增殖周期有所增高（加药组与生理盐水对照组相比,差异有显著性,p＜0.05）。2.猪苓多糖组体内干预能够增加荷H22肝癌小鼠脾指数,与生理盐水对照组相比,p＜0.05;而其增加荷H22肝癌小鼠胸腺指数效果不明显,与生理盐水对照组比较,p＞0.05。此外,猪苓多糖组能够提高荷H22肝癌小鼠抑瘤率,抑制肿瘤的生长,与生理盐水对照组相比差异有统计学意义。结论1.猪苓多糖能够促进荷H22肝癌小鼠髓源性树突状细胞增殖。2.猪苓多糖在冻融抗原协同下促进小鼠DC分化成熟,提高其表面CD86及CD11a分子表达,提高DC诱导的CTL特异性杀伤能力。3.猪苓多糖对荷瘤小鼠免疫功能有正性调节作用,可抑制机体肿瘤的生长。