禽网状内皮组织增生症病毒感染对SPF鸡主要免疫器官白细胞介素2产生的影响

论文摘要

白细胞介素-2是由激活的T淋巴细胞产生的一种细胞因子，这种细胞因子具有诱导T细胞增殖，促进B细胞分化及分泌抗体，诱导产生其他细胞因子，增强单核细胞、NK细胞以及LAK细胞的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有非常重要的免疫调节作用，因此，它在许多疾病的基础性研究和临床应用中有重要价值。目前，免疫抑制病对我国集约化养鸡业造成了很大的危害，禽网状内皮组织增生症病毒感染后可导致体液和细胞介导免疫应答的严重抑制已有很多报道，了解免疫抑制机理并制定提高鸡的免疫应答策略正成为当前的研究热点。本研究以禽网状内皮组织增生症病毒人工接种SPF鸡造成的免疫抑制为模型，对鸡白细胞介素2在免疫抑制中可能发挥的作用进行了初步探讨。研究内容主要包括两部分：1.成功建立了检测鸡白细胞介素2的SYBR Green Ι荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank上发表的鸡白细胞介素2的基因序列，在保守区设计并合成特异性引物，并以核糖体蛋白亚基4基因为内参，采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。将白细胞介素2与核糖体蛋白亚基4部分基因克隆至pMD18-T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，该方法对鸡白细胞介素2mRNA的扩增效率为113%，线性范围为10-210-6，相关系数为0.9928，最低能检出100拷贝/μL；熔解曲线分析荧光定量RT-PCR产物在（80.2±0.8）℃出现单特异峰；从RNA提取到荧光定量PCR结束的检测周期只需4h。本研究所建立的鸡白细胞介素2基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在转录水平对鸡IL-2的定量分析奠定了基础。2.实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡主要免疫器官中白细胞介素2基因表达量的研究。为了研究鸡白细胞介素2基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡体内的表达水平，120只1日龄SPF鸡随机分为2组，禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个组分别在感染后7、14、21、28、35、42和49d随机取6只鸡处死，迅速取胸腺、脾脏和法氏囊样品用于RNA提取。应用所建立的SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量RT-PCR方法，比较处理组和对照组IL-2基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，与对照组相比，处理组胸腺、脾脏和法氏囊中IL-2基因的表达量在感染后7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高，除了21、28日龄鸡的脾脏外，其他均为显著差异（P<0.05）。本实验为探讨禽网状内皮组织增生症病毒感染的免疫抑制机理打下了一定基础。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鸡白细胞介素 2 的研究进展
• 1.1.1 鸡 IL-2 的克隆及其基因结构特点
• 1.1.2 鸡 IL-2 的生物学活性
• 1.1.3 鸡 IL-2 的生物活性检测
• 1.2 鸡 IL-2 的应用研究
• 1.2.1 作为免疫治疗剂
• 1.2.2 作为免疫增强剂
• 1.2.3 用于构建新型基因工程苗
• 1.3 REV 研究进展
• 1.3.1 病原学
• 1.3.2 流行病学
• 1.3.3 免疫抑制机理
• 1.3.4 症状及病理变化
• 1.4 细胞因子的检测
• 1.4.1 细胞因子检测的意义
• 1.4.2 细胞因子检测方法
• 1.4.3 鸡病毒性免疫抑制病中细胞因子的检测
• 1.5 实时荧光定量 PCR 研究进展
• 1.5.1 实时荧光定量 PCR 的原理
• 1.5.2 实时荧光定量 PCR 的分类
• 1.5.3 实时荧光定量 PCR 的定量方法
• 1.5.4 实时荧光定量 PCR 的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与载体
• 2.1.2 实验动物与病毒
• 2.1.3 试剂与耗材
• 2.1.4 仪器与设备
• 2.1.5 实验室常用各种培养基和溶液的配制
• 2.1.6 引物设计及合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 鸡白细胞介素 2 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 2.2.2 REV 对 1 日龄 SPF 鸡的致病性观察
• 2.2.3 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-2 基因表达量的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡白细胞介素 2 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 3.1.1 IL-2 部分基因重组质粒的构建结果
• 3.1.2 RPL4 部分基因重组质粒的构建结果
• 3.1.3 荧光定量 PCR 建立的结果
• 3.1.4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 的建立
• 3.2 REV 对 1 日龄 SPF 鸡的致病性观察
• 3.2.1 临床症状
• 3.2.2 死亡统计
• 3.2.3 免疫器官指数影响
• 3.3 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-2 基因表达量的研究
• 4 讨论
• 4.1 鸡白细胞介素 2 SYBR GreenⅠ荧光定量 RT-PCR 方法的建立
• 4.2 REV 对 1 日龄 SPF 鸡的致病性观察
• 4.3 实时荧光定量 RT-PCR 检测 REV 感染 SPF 鸡主要免疫器官 IL-2 基因表达量的研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况