论文摘要
研究背景整合子（Integron）是存在于细菌基因组或质粒上的基因片段,具有位点特异性重组功能,且能够识别并捕获移动性基因盒。基因盒是整合子所携带的基因片段,常携带各种基因赋予整合子某方面的表型,其中很多是耐药基因。整合子本身不能转移,但其携带的耐药基因盒可以通过整合酶在特异位点的酶切反应,在整合子间转移或转移到其他细菌基因组中。因此整合子在细菌获得性耐药机制中发挥了重要的作用。铜绿假单胞菌（Pseudomanos aeruginos,P.A）是医院感染常见的条件致病菌,且对多种抗生素存在天然和获得性多重耐药,其耐药机制复杂。碳青霉烯类抗生素是治疗难治性铜绿假单胞菌感染的有效选择,但由于抗生素的不合理不规范使用,出现了很多耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌。因此研究碳青霉烯类抗生素的耐药机制对于临床合理用药具有很大的指导意义。实验目的研究Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在革兰阴性菌中的分布,及其携带的耐药基因盒。以铜绿假单胞菌为例,研究金属酶、整合子及外膜蛋白在多重耐药革兰阴性菌中所起的作用,并探索三者的相关性。为指导临床抗生素使用提供理论依据。实验方法和结果1.革兰阴性菌中整合子的鉴定及其耐药基因盒的种类收集中南大学湘雅三医院2006年9月到2007年6月,多重耐药革兰阴性菌183株。根据各型整合酶和整合子已知基因序列设计引物,进行PCR初筛并分型整合子;PCR扩增整合子可变区,限制性片段多态性分析（RFLP）鉴定整合子可变区的同一性;PCR产物测序分析整合子所携带的基因盒种类。结果:Ⅰ型整合子的阳性率为54.6%（100/183）。发现四种整合子结构,分别是blaVIM-2-aacA-Ib-aadA2-qacE,dfrA12-aadA2-qacE-blaCTX-M-2,dhfrXⅡ-orfF-aadA2,dhfrXⅡ-orfF-aadA2-sul1。分别携带编码碳青酶烯类、β-内酰胺类、氨基糖苷类及磺胺类耐药基因。无Ⅱ、Ⅲ类整合子检出。2.耐碳青酶烯铜绿假单胞菌的耐药机制分析选取42株铜绿假单胞菌,用EDTA协同实验分析各菌株所产金属β-内酰胺酶（MBL）;PCR扩增其整合酶和整合子基因,测序确定其耐药基因盒;RT-PCR半定量测定外排泵结构基因mexA的表达水平:Western Blot测定外排泵结构蛋白MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN的表达水平,以分析铜绿假单胞菌的耐碳青霉烯类抗生素的机制,及各机制之间的相关性。结果:产金属β-内酰胺酶的比例为52.4%,整合子的检出率为64.3%,外膜蛋白OprM高表达。结论1.Ⅰ型整合子是我院的主要传播类型,其所携带的基因盒种类和数量不等。2.铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗生素主要与产金属β-内酰胺酶、外排泵高表达相关。整合子只表达对氨基糖苷类耐药。
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