利用体细胞核移植技术生产转基因克隆梅山猪

论文摘要

由于在解剖、生理、遗传等方面比小鼠更加接近于人类，作为重要的经济动物的猪被认为是人异种器官移植理想的器官提供者及开展人类疾病研究的主要动物模型。猪器官的获得及模型的制备需要借助胚胎工程提供丰富的素材。当前，以体细胞克隆、转基因、多能干细胞等技术为代表的猪的胚胎工程尚不完善，尤其是起始材料——体外培养得到的猪卵母细胞、胚胎质量不高，反映出猪卵母细胞、胚胎体外培养体系不理想。因此，需进一步优化猪卵母细胞体外成熟、胚胎培养体系。本研究首先尝试添加重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），以期获得高效、经济、稳定的猪卵/胚胎体外培养配方；还针对胚胎远距离运输的现实需要，研制了高效、经济、实用的胚胎运输装备，为胚胎生产/利用效率提高、转基因克隆猪生产奠定基础。实验一旨在借助性染色体特异片段设计的引物，通过双基因PCR法快速鉴定猪胎儿成纤维细胞。对实验室的七株梅山猪成纤维细胞系提取细胞基因组DNA，根据X,Y染色体上的特异性片段Sry、ZFx/y设计两条特异性引物， PCR法快速成纤维细胞系进行性别鉴定。成功鉴定出msz4、msz5、msz11、msz15四个雄性细胞系， msz6、msz9、msz14三个雌性细胞系。实验二首先研究hGM-CSF添加至非限定性成熟培养基（PIVM）中对猪卵母细胞成熟的影响。实验组分别添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的hGM-CSF，对照组不添加hGM-CSF（即0ng/ml）。我们发现PIVM添加2ng/ml、10ng/ml或50ng/ml的hGM-CSF对卵母细胞成熟率无显著影响。而100ng/ml组所获成熟卵孤雌后囊胚率与对照组相比明显下降（34.83±5.50%vs.58.83±4.55%，P<0.05），虽然卵母细胞的成熟率无明显改变。随后，我们又在化学限定性培养基（不含任何蛋白成分的PIVM）里添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的hGM-CSF（0ng/ml为对照组），以探明hGM-CSF对猪卵母细胞成熟的真实影响，成熟率亦没有显著变化（53.63±4.68%、45.38±3.03%、49.63±1.35%、52.13±2.72%，P>0.05），且成熟卵孤雌后胚胎后期的发育率也没有显著差异（25.88±3.69%、29.87±4.10%、24.63±5.27%、23.75±3.63%， P>0.05）。我们还研究了hGM-CSF（胚胎培养期间，在PZM3中分别添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的hGM-CSF，以不添加组为对照）对猪孤雌胚体外发育的影响。结果表明，胚胎培养期间，在非限定胚胎培养基PZM3中添加hGM-CSF对卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率均无促进作用（P>0.05），但是添加10ng/ml、50ng/ml的hGM-CSF组，可以提高囊胚总细胞数（79±7、79±8、48±5，P＜0.05）。在化学限定胚胎培养基PZM4中添加上述浓度的hGM-CSF，胚胎卵裂率（90.43±2.41%、90.43±2.41%、90.57±2.82%、90.57±1.90%，P>0.05），囊胚率（18.57±5.48%、16.14±4.70%、18.57±4.47%、17.86±5.61%，P>0.05）无明显改善。实验三：旨在研究bFGF对卵母细胞成熟的影响，以筛选出有益于提高猪卵成熟质量的bFGF添加浓度及时间。处理组添加2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的bFGF（不含bFGF的培养基作为对照组）。实验结果表明，10ng/ml的bFGF可显著提高卵母细胞的成熟率（84.17±3.51%vs68.83±3.72%，P<0.05）及孤雌后的囊胚率（56.67±3.96%vs34.33±4.57%，P<0.05）、囊胚孵化率（10.50±4.99%vs0.00±0.00%，P<0.05）和囊胚总细胞数（65±4vs34±4，P<0.05）。为探明bFGF对猪孤雌胚胎体外发育的影响，我们分别将2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml的bFGF（对照组为不含bFGF的胚胎培养基）加入胚胎培养基中，对常规体外成熟的卵母细胞进行孤雌激活、培养，通过胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚孵化率以及总细胞数综合判定bFGF的作用。结果表明，当使用非化学限定培养基PZM3时，添加bFGF对孤雌胚体外发育影响不明显；而在化学限定性胚胎培养基PZM4中添加不同浓度bFGF（0ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml）的孤雌胚的囊胚发育率（25.40±7.90%、37.60±6.52%、36.40±3.52%、29.40±3.43%，P>0.05）和囊胚孵化率（0.00±0.00%、0.00±0.00%、1.60±1.60%、0.00±0.00%，P>0.05）有提高的趋势，尽管无显著性差异。实验四：尝试用研制简易运输装置以替代昂贵的商业化细胞培养输送器运输胚胎。以实验室CO2培养箱连续培养作为对照组，揭示自制胚胎运输器运输、运输时间对胚胎体外发育的影响。结果表明，除自制装置运输2h组之外，囊胚率方面其他组都较对照组略有下降（P>0.05）。自制装置不同运输时间均获得孵化囊胚，尤其是2h组明显优于其他各组（P＜0.05）。自制装置运输2h组、3h组、细胞输送器4h运输组的ICM数/总细胞数比值显著高于其他组（P＜0.05）。实验五：我们从201010月起，以梅山猪转基因细胞系（msz6-转pEGFP-N1）为供体共构建1080枚胚胎，移植给9头代孕母猪输卵管内，其中1头代孕母猪产下四头健康仔猪。经PCR检测，均为转基因克隆猪。综上所述，本实验首先利用SRY-PCR法快速准确的鉴定出七株梅山猪成纤维细胞系的性别，并发现：在猪的卵母细胞体外成熟和胚胎的体外培养中，添加hGM-CSF不能显著的促进卵母细胞成熟和胚胎的发育，10ng/ml的bFGF显著提高卵母细胞的核成熟和胞质成熟，而将bFGF仅添加于胚胎培养基中，对胚胎的发育和质量却无显著影响。我们自制的细胞简易运输装置、经济、易操作，使用该装置在3h时间内运输胚胎效果最佳。利用所建立的体细胞克隆平台，我们获得了安徽省首例体细胞克隆转基因梅山猪。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 文献综述
• 1.动物体细胞克隆效率的优化
• 1.1 供体细胞
• 1.2 受体胞质
• 1.3 核移植操作
• 1.4 重构胚的融合与激活
• 1.5 胚胎的培养及胚胎移植
• 2.克隆猪的应用和发展前景
• 2.1 抗病育种
• 2.2 乳腺生物反应器
• 2.3 疾病模型与器官移植供体
• 2.4 改善肉质
• 3.展望
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 实验主要仪器
• 1.1.2 实验耗材
• 1.1.3 主要试剂及配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 不同猪成纤维细胞系基因组的提取
• 1.2.2 猪卵母的体外细胞成熟
• 1.2.3 猪卵母细胞孤雌
• 1.2.4 猪体细胞核移植
• 1.2.5 胚胎运输和移植
• 1.2.6 卵母细胞卵丘扩散程度判定
• 1.2.7 透明带厚度测量
• 1.2.8 囊胚总细胞计数染色
• 1.2.9 差异染色
• 1.3 试验设计
• 1.3.1 利用 SRY-PCR 法快速对猪胎儿成纤维细胞系的性别鉴定
• 1.3.2 hGM-CSF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 1.3.3 bFGF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 1.3.4 不同的胚胎运输方式和运输时间对胚胎后期发育的影响
• 1.4. 统计分析
• 2. 实验结果
• 2.1. 利用 SRY-PCR 法快速鉴定猪胎儿成纤维细胞性别
• 2.1.1 细胞基因组 DNA 的浓度与纯度
• 2.1.2 PCR 扩增及其检测结果
• 2.2 hGM-CSF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 2.2.1 hGM-CSF 添加至非限定性成熟培养基对卵母细胞成熟及其孤雌胚后期发育的影响
• 2.2.2 hGM-CSF添加至完全限定性成熟培养基对卵母细胞成熟及其孤雌胚后期发育的影响
• 2.2.3 hGM-CSF 添加至胚胎培养基（PZM3）对孤雌胚后期发育的影响
• 2.2.4 hGM-CSF 添加至限定性胚胎培养基（PZM4）对孤雌胚后期发育的影响
• 2.3 bFGF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 2.3.1 不同浓度 bFGF 对卵母细胞成熟及其对孤雌胚后期发育的影响
• 2.3.2 bFGF 添加至胚胎培养基（PZM3）对孤雌胚后期发育的影响
• 2.3.3 bFGF 添加至限定性胚胎培养基（PZM4）对孤雌胚后期发育的影响
• 2.4 不同的胚胎运输方式和运输时间对胚胎后期发育的影响
• 2.4.1 自制简易胚胎运输装置随着运输时间的降温曲线
• 2.4.2 不同的胚胎运输方式和运输时间对胚胎后期发育的影响
• 2.5 转基因克隆梅山猪胚胎移植结果及 PCR 鉴定
• 3. 讨论
• 3.1 SRY-PCR 法快速对猪胎儿成纤维细胞系的性别鉴定
• 3.2 hGM-CSF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 3.3 bFGF 对猪卵母细胞成熟和孤雌胚发育的影响
• 3.4 不同的胚胎运输方式和运输时间对胚胎后期发育的影响
• 3.5 转基因克隆梅山猪的胚胎移植结果
• 4. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历