重组改构人肿瘤坏死因子增强顺氯氨铂抑制小鼠Lewis肺癌的作用及机制研究

论文摘要

目的:肺癌是全世界常见的恶性肿瘤,5年生存率仅10%左右。尽管近年来新的抗癌药物和化疗方案不断推出,但治疗效果仍无显著提高。如何寻找一种有效措施以提高化疗疗效是目前亟待解决的问题。生物化疗（Biochemotherapy）是生物治疗与化疗相结合的方法,与单用化疗相比,有疗效迭加及减轻毒副反应的作用,是目前肿瘤综合治疗新动向之一。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）属于生物制剂中细胞因子类,而细胞因子类的应用是目前最成熟的生物治疗方法[1]。本实验拟通过动物实验观察重组改构人肿瘤坏死因子（recombinant mutant human tumor necrosis factor,rmhTNF）是否能增强顺氯氨铂（cisplatin,DDP）对小鼠Lewis肺癌的化疗疗效,进一步阐明抗肿瘤血管生成是其增效化疗可能的作用机制之一,同时观察rmhTNF是否有改善免疫功能的作用,初步探讨rmhTNF联合DDP治疗肺癌的可行性。方法:将体重为1620克健康C57BL/6小鼠（60只）随机分为4组,生理盐水对照组（对照组,15只）,rmhTN- F单药组（15只）,DDP单药组（15只）,DDP+rmhTNF联合组（联合组,15只）。然后将小鼠Lewis肺癌（LLC）细胞株接种于各组小鼠右上肢腋窝皮下,构建动物实验模型[2]。随后隔日检查皮下肿瘤生长情况。接种第5天,约半数能扪及肿瘤,第7天,都能扪及肿瘤,待第12天,扪及皮下肿瘤平均大小约（1.0×1.0×1.0）cm3时开始进行瘤内注药[3、4]。对照组瘤内注射生理盐水0.2mL/只,rmhTNF单药组瘤内注射rmhTNF 0.2mL/只（150万IU/kg）,DDP单药组瘤内注射DDP 0.2mL/只（6.15mg/kg）,联合组瘤内注射DDP（6.15mg /kg）和rmhTNF （150万IU/kg）各0.2mL/只。以上四组每天给药一次,连续3天[5],给药第一天开始观察小鼠的生活状态。末次给药后24小时集体脱颈处死小鼠,立即完整剥离肿瘤组织,称取并记录每个瘤体的重量（g）及小鼠去肿瘤后重量（g）,测量并计算每个肿瘤体积（mm3）,各组肿瘤抑制率,同时取瘤组织,通过逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR,RT-PCR）半定量检测低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）mRNA的表达水平。应用免疫组织化学（immunohistoche- mistry,IHC）方法定性观察血管内皮生长因子（vascular endot- helial growth factor,VEGF）及其受体（vascular endothelial gro- wth factor receptor-2,VEGFR-2/KDR）蛋白的表达情况。采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）半定量检测基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）蛋白的表达水平。结果:1小鼠生活状态、最终去瘤体重:各治疗组小鼠均有轻到中度的脱毛,食欲下降,活动迟缓,精神萎靡,rmhTNF单药组生活状态最佳,联合组较DDP单药组生活状态好。rmhTNF组的小鼠最终去瘤体重高于对照组（P<0.05）,其他治疗组小鼠最终去瘤体重与对照组相比均有下降（P<0.05）,联合组小鼠的最终去瘤体重高于DDP组（P<0.05）。2瘤重、体积、抑瘤率:单药组平均肿瘤体积和平均瘤重均低于对照组（P<0.05）;联合组的肿瘤体积、平均瘤重低于各单药组（P<0.05）,抑瘤率高于各单药组（P<0.05）。两单药组之间无明显差异（P>0.05）。3半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA结果:两单药组的HIF-1αmRNA表达水平较对照组明显下降（P<0.05）,联合组的表达水平明显低于两单药组（P<0.05）,两单药组之间无明显差异（P>0.05）。4免疫组化检测VEGF、KDR蛋白表达结果:两单药组VEGF、KDR表达均低于对照组（P<0.05）,联合组VEGF、KDR表达均低于各单药组（P<0.05）,两单药组表达水平之间无显著差异（P>0.05）。5 VEGF和KDR蛋白表达相关性检测结果:免疫组化结果显示小鼠Lewis肺癌组织的对照组、rmhTNF组、DDP组和联合组的VEGF和KDR蛋白表达均具有正相关性,r值分别为0.703,0.538,0.644,0.608,P值分别为0.003,0.039,0.010,0.016。6流式细胞术检测MMP-2结果:单药组的MMP-2表达水平较对照组明显下降（P<0.05）,联合组的表达水平明显低于两单药组（P<0.05）,两单药组之间无明显差异（P>0.05）。结论:1 rmhTNF和DDP单用对小鼠Lewis肺癌均有抗瘤特性,而两药联合作用明显增强,rmhTNF能够增强DDP对小鼠Lewis肺癌的抑制作用,并能改善小鼠的免疫功能。2 rmhTNF和DDP单用均能抗肿瘤血管生成,而联合应用其抗肿瘤血管生成作用更加显著,进一步反映rmhTNF可能通过抗肿瘤血管生成的机制增强化疗疗效。3 rmhTNF、DDP可能通过基因水平上对HIF-1α的抑制,导致HIF-1α蛋白水平的表达降低,从而降低VEGF蛋白的表达,进一步影响KDR蛋白的表达;同时也可以抑制MMP-2蛋白的表达,从而抑制肿瘤血管生成,最终达到抗肿瘤的作用。4小鼠Lewis肺癌中有HIF-1αmRNA、VEGF、KDR和MMP-2的表达,且VEGF和KDR的表达有明显的正相关性。5本实验为rmhTNF和化疗药物联合应用治疗肺癌以提高疗效提供了理论依据,为肺癌的综合治疗提供了新的选择。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 重组改构人肿瘤坏死因子增强顺氯氨铂抑制小鼠Lewis 肺癌的作用及机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 抗肺癌血管生成机制及靶向治疗药物研究进展
• 致谢
• 个人简历