酵母双杂交筛选猪血管内皮细胞中与猪瘟病毒NS2蛋白相互作用的蛋白

论文摘要

猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的猪瘟（Classical swine fever, CSF）被世界动物卫生组织（OIE）列为必须上报的动物传染病之一。由于CSFV体外培养增殖滴度低且不引起细胞病变,所以国内外对CSFV的研究大多侧重于病毒的检测以及新型疫苗的研发,而对CSFV的致病机理研究相对较少。NS2蛋白为CSFV的一个非结构蛋白。现有资料表明,NS2蛋白通过与宿主细胞的相互作用对CSFV的复制有一定调节作用,并产生蛋白酶活性,切割NS2-3复合体释放NS3单体,而NS3单体的积聚会使接毒培养的细胞出现细胞病变（CPE）。但是目前对NS2蛋白与宿主细胞的相互作用以及调节病毒RNA复制的机制依然不很清楚。本文以研究NS2蛋白与宿主细胞蛋白相互作用为目标,采用酵母双杂交技术,对CSFV宿主细胞猪血管内皮细胞（SUVEC）中与NS2蛋白相互作用的蛋白进行了筛选。获得了以下研究结果:（1）从pGFP-NS2绿色荧光表达载体中扩增得到NS2基因C末端360 bp的编码区,并构建到pGBKT7-NS2-C360诱饵表达载体中,获得了对酵母细胞无毒性且没有自激活性的pGBKT7诱饵表达载体。（2）成功分离、纯化了猪血管内皮细胞双链cDNA,用来表达猎物文库的融合蛋白。（3）将pGBKT7-NS2-C360载体、双链cDNA、猎物载体pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞,经过筛选获得16个阳性克隆。经PCR、测序、比对分析获得8种与CSFV具有相互作用的已知蛋白,分别为胞质溶胶非特异2肽酶（CNDP2）、热休克蛋白40（Hsp40）、CFTR相关配体（CAL）、E3泛激素连接酶、ATP合成酶6 （ATPase6）、NRAS相关蛋白、细胞凋亡调节基因（MOAP1）和核糖核蛋白H1。本试验筛选得到8种已知蛋白,其中Hsp40蛋白的重复性比较高,且现有资料表明,Hsp40参与调节病毒RNA的复制。所以Hsp40将作为所筛选蛋白进一步研究的重点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪瘟病毒NS2 蛋白研究进展
• 1.1 NS2 蛋白与猪瘟病毒非致细胞病变型型向致细胞病变型转化
• 1.2 猪瘟病毒NS2 蛋白酶作用以及切割NS2-3 复合体
• 1.3 NS2 蛋白特性与宿主细胞相互作用研究
• 第二章 酵母双杂交系统及发展应用
• 2.1 酵母双杂交系统的理论甚础
• 2.2 酵母双杂交系统的改进与发展
• 2.3 酵母双杂交技术的应用
• 2.4 酵母双杂交系统的优点与局限性
• 2.4.1 酵母双杂交系统优点
• 2.4.2 酵母双杂技系统缺点
• 2.5 酵母双杂交技术前景展望
• 试验研究
• 第三章 诱饵载体pGBKT7-NS2-C360 的构建及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 试剂及试剂盒
• 3.1.3 培养基及其配制
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 诱饵载体pGBKT7-NS2-C360 的构建
• 3.2.2 重组质粒pGBKT7-NS2-C360 对酵母细胞毒性以及自激活性的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 扩增NS2-C360 目的基因
• 3.3.2 诱饵质粒pGBKT7-NS2-C360 的酶切分析和PCR 鉴定
• 3.3.3 酵母菌落PCR 鉴定
• 3.3.4 诱饵蛋白自激活与毒性检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 猪血管内皮细胞双链cDNA 的制备
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 试剂与试剂盒
• 4.1.3 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 猪血管内皮细胞的复苏与培养
• 4.2.2 细胞总RNA 的提取与纯度分析
• 4.2.3 第一链cDNA 合成
• 4.2.4 长距离PCR（LD-PCR）扩增dsDNA
• 4.2.5 dsDNA 产物的纯化
• 4.3 结果
• 4.3.1 总RNA 的提取
• 4.3.2 cDNA 的合成与纯化
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 酵母双杂交筛选与CSFV NS2 蛋白相互作用的蛋白
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株、质粒
• 5.1.2 试剂及试剂盒
• 5.1.3 培养基及配制
• 5.1.4 仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 pGBKT7-NS2-C360，pGADT7-Rec，双链cDNA 共转化AH109
• 5.2.2 对照菌株的转化
• 5.2.3 阳性菌落的筛选与鉴定
• 5.2.4 文库质粒的解救与测序
• 5.3 结果
• 5.3.1 共转化结果
• 5.3.2 阳性克隆筛选结果
• 5.3.3 阳性克隆的鉴定
• 5.3.4 测序结果
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介