论文摘要
心肌梗死是缺血性心脏病的严重且致死率极高的一种临床表现形式。冠状动脉旁路移植术（CABG）和经皮冠状动脉干预（PCI）对冠心病的治疗已比较成熟,但对于冠状动脉弥漫性病变及陈旧性心肌梗死心功能较差者效果尚不理想。基因治疗是缺血性心脏病的新探索。血管内皮生长因子（Vascular EndothelialGrowth Factor,VEGF）也称为血管通透因子（vascular permeability factor,VPF）,对血管内皮细胞具有高度特异性促有丝分裂作用。其通过与血管内皮细胞的特异性受体结合,具有强大的促内皮细胞增殖、促进血管生成作用。研究发现,其他血管生成因子的作用是全部或部分通过增强VEGF的表达及生成实现的。促进VEGF表达或利用基因治疗方式给予心肌缺血患者VEGF,促进心肌局部VEGF表达,增加缺血心肌血管生成,为心肌缺血治疗提供新的治疗方式。目的建立大鼠急性心肌梗死模型,将以腺病毒为载体的人血管内皮生长因子(Ad-hVEGF121)注射感染至心肌内,观察其对缺血心肌血管生成、心室结构和功能以及心肌细胞凋亡的影响,探讨其治疗心肌梗死的可能机制。方法1.构建hVEGF121腺病毒表达载体。利用293T细胞包装扩增Ad-hVEGF121重组腺病毒,获取大量含hVEOF121的腺病毒;用PCR法鉴定扩增的腺病毒;用光密度法在OD260测定腺病毒滴度。2.将78只清洁级雄性SD大鼠,体重250～300g随机分为四组:心梗+VEGF感染组（AMI/VEGF组）,心梗+生理盐水组（MI/NS组）,单纯心梗组（AMI组）和假手术组（sham组）。VEGF组、MI/NS组、AMI组都行结扎冠状动脉前降支而假手术组只穿线不结扎。3.结扎冠状动脉后稳定10～15分钟,VEGF组和MI/NS组用微量注射器分别向心肌梗死区分三点直接注射Ad-hVEGF121或NS(每点20μl,总量为×1010vp),AMI组结扎后关闭胸腔,术后继续喂养2周。术后14天行心脏超声检查左室结构和心功能。超声检查后处死大鼠,取出心脏剪去心房和右室,将室间隔保留在左室,垂直于左室长轴将左室分成上下两部分,上部分置-80℃冻存,用于提取总RNA并用RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3及hVEGF121的mRNA表达。下部分经甲醛固定后,石蜡包埋切片,进行HE染色,计算梗死面积;免疫组化vWF染色计数毛细血管密度;TUNEL法计数细胞凋亡率。结果1.用293T细胞包装扩增的Ad-hVEGF121腺病毒,扩增后病毒滴度为1.155×1012v.p/ml。PCR扩增产物为476bpDNA片段,显示成功构建重组腺病毒Ad-hVEGF121。2.阻断大鼠冠状动脉前降支血流后,心电图显示ST段抬高,QRS综合波幅度增高,术后14天的大鼠心脏大体标本可见左室局部苍白,室壁明显变薄,无血管瘤生成。HE染色可见左室前壁局部穿壁梗死灶。模型成功率67.9%。3.实验终点时,心肌梗死各组大鼠的体重较sham组大鼠明显减轻（p＜0.01）。超声心动图结果显示,心肌梗死大鼠均表现LVEDd和LVEDs增大,与sham组大鼠比较有显著差异（p＜0.05）。直接心肌注射Ad-hVEGF121能在一定程度缩小大鼠左室内径和左室重量/体重比值,增加LVEF,但与MI/NS和MI组大鼠比较无统计学差异（p＞0.05）。4.HE染色结果显示,除sham组外,各组间梗死面积无显著差异（p＞0.05）。免疫组化vWF阳性内皮细胞测量结果显示:心肌梗死大鼠新生毛细血管密度较sham组显著增多（p＜0.001）,转染rAd-hVEGF121大鼠新生毛细血管密度较MI/NS组和AMI组增加（p＜0.05）。5.RT-PCR结果显示,AMI后2周,梗死组大鼠梗死区bcl-2、bax和caspase-3的mRNA表达明显增加,与sham组比较有显著差异（p＜0.01）。但转染rAd-hVEGF121大鼠的bcl-2和bax的mRNA表达灰度值与AMI和MI/NS组比较无差异（p＞0.05）。TUNEL结果显示,VEGF组心肌细胞凋亡率较MI/NS组和AMI组显著降低（p＜0.05）,而且以梗死周围区凋亡明显。结论:1.结扎大鼠冠状动脉前降支能成功构建稳定的急性心肌梗死大鼠模型;2.直接心肌注射Ad-hVEGF121(1×1010vp)能在一定程度改善心肌梗死大鼠心脏结构和心功能,这可能与其增加新生毛细血管密度,降低心肌细胞凋亡有关;3.Ad-hVEGF121并非通过上调凋亡抑制因子bcl-2和下调凋亡促进因子bax的表达而抑制心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡,可能是通过改善“凋亡调节因子”bcl-2/bax和下调caspase-3表达实现的;4.每只大鼠心肌注射Ad-hVEGF121(1×1010vp)无明显副作用,是安全的。
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