OsMAPK4基因水稻突变体的培育及功能分析

论文摘要

土壤盐渍化是制约各种作物生长和结实的主要原因,是影响我国乃至世界农业生产的重大问题。研究植物耐盐机理,寻找与盐耐受相关的关键基因,并通过植物基因工程技术培育出耐盐碱的转基因作物是目前世界上各国科学家研究的热点。促分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activited protein kinases,MAPKs）基因是普遍存在于真核生物中的一类丝氨酸/苏氨酸类激酶。植物细胞感受环境胁迫（如干旱、低温、盐碱等）后,可以激活MAPKs,最终引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应。OsMAPK4基因是MAPKs家族B组的一个成员。现已在水稻中发现,在高盐、低温条件下OsMAPK4基因的表达迅速上调。本研究构建了由Ubi强启动子调控的OsMAPK4基因的RNAi载体pCMI。利用农杆菌介导法将pCMI及OsMAPK4基因的超量表达载体pCME12导入黑龙江省优良水稻品种“五优稻一号”。经Bialaphos对PCR阳性植株T1代幼苗的筛选及抗性苗的PCR检测,获得了能够稳定遗传的T1代转基因植株。分析了转pCME12 T1代水稻植株的耐盐性。获得OsMAPK4基因下调表达的转pCMI植株2个和OsMAPK4基因上调表达的转pCME12植株2个。Real-time PCR分析了150mM NaCl诱导前后高表达植株、低表达植株与野生型植株中OsMAPK4基因的转录情况。经过芯片杂交和表达谱分析,发现盐诱导后转pCME12植株中,上调表达基因1022个,有GO注释的116个;转pCMI植株中,下调表达基因1654个,有GO注释的260个。其中,有37个为注释后相同的基因。分析这37个基因的功能与注释信息,最后筛选出与耐盐过程密切相关的基因13个,分为信号转导、基因表达调控和耐盐功能基因3类。主要研究结果如下:1.构建了OsMAPK4基因的RNAi载体pCMI该载体含有长度为143bp的OsMAPK4基因的反向重复序列和232bp的内含子序列。转录后反向重复序列可相互配对,形成发卡,加工、处理成为小的短链RNA分子,启动OsMAPK4基因转录后水平的基因沉默。2.获得了转pCMI和转pME12水稻PCR阳性植株利用农杆菌介导法对水稻“五优稻1号”进行遗传转化,获得转pCMI抗性植株38株,转pME12抗性植株23株。PCR阳性植株分别为10株、11株,PCR阳性率分别为26.3%、47.8%。收获PCR阳性植株T1代种子。3.筛选得到抗Bialaphos且PCR检测呈阳性的T1代植株经含有6mg/L Bialaphos的M0培养基对PCR阳性植株T1代幼苗的筛选,得到转pCMI抗性株系5个,转pCME12抗性株系7个。从其中每个抗Bialaphos的株系中随机选取2个植株进行PCR检测,分别获得阳性植株9株和12株。4.分析了转pCME12 T1代水稻植株的耐盐性在含有0.2mol/L浓度NaCl的M1培养基上检测了11株转pCME12 PCR阳性植株的T1代种子的耐盐性,其中3株具有明显耐受性。说明OsMAPK4基因在种子萌发期及幼苗生长期增强了转基因水稻的耐盐性。5.检测了转基因植株中OsMAPK4基因的转录水平（1）筛选了Real-time PCR检测引物:β-actin内参基因引物及OsMAPK4基因特异引物各1对。（2）对T1代抗Bialaphos植株进行了Real-time PCR检测,检测的5个转pCMI的植株中,有2个株系OsMAPK4基因转录水平低于非转基因植株,降低水平分别为未转基因植株的1/7、1/9;检测的3个转pCME12的植株中,有2个株系OsMAPK4基因转录水平高于非转基因植株,提高水平分别为未转基因植株的3.6、2.3倍。（3）对150mM NaCl诱导前后转基因植株中OsMAPK4基因的表达水平进行了Real-time PCR检测。在转pCMI的两个植株中,OsMAPK4基因的转录水平为未诱导之前的0.41、0.69倍;转pCME12的两个株系中,OsMAPK4基因的转录水平分别为未诱导之前的1.23、1.69倍。6.转基因植株的转录组分析（1）分析了转OsMAPK4基因水稻突变体在150mM NaCl诱导前后基因表达谱的差异,发现盐诱导后转pCME12植株中,上调表达基因1022个,有GO注释的116个;转pCMI植株中,下调表达基因1654个,有GO注释的260个。其中,有37为注释后相同的基因。（2）分析37个基因的功能与注释信息,最后筛选出与耐盐过程密切相关的基因13个,分为信号转导、基因表达调控和耐盐功能基因3类。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 本研究的目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 植物对盐胁迫的反应和耐盐性
• 1.2.2 植物盐胁迫信号的转导过程
• 1.2.3 MAPKs 在植物耐受渗透胁迫过程中的作用研究
• 1.2.4 RNAi 技术及其在植物中的应用研究
• 1.2.5 基因芯片技术的应用及表达谱的分析
• 1.3 本论文的主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 OSMAPK4 基因RNAI 载体PCMI 的构建
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 农杆菌介导法转化水稻
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 抗性水稻植株的PCR 检测
• 2.3.1 试验材料
• 2.3.2 试验方法
• 2.4 PCR 阳性植株T1 代幼苗的BIALAPHOS 筛选及PCR 检测
• 2.4.1 PCR 阳性植株T1 代幼苗的Bialaphos 筛选
• 2.4.2 抗Bialaphos 植株的PCR 检测
• 2.5 转PCME12 的PCR 阳性植株T1 代幼苗的耐盐性检测
• 2.5.1 试验材料
• 2.5.2 试验方法
• 2.6 目的基因转录的实时荧光定量PCR （REAL-TIME PCR）检测
• 2.6.1 试验材料
• 2.6.2 试验方法
• 2.7 转基因植株的转录组分析
• 2.7.1 水稻OsMAPK4 基因芯片杂交材料的准备
• 2.7.2 芯片杂交结果的生物信息学分析方法
• 2.7.3 OsMAPK4 基因下游基因的分析
• 2.8 统计分析方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 植物低表达载体pCMI 的构建
• 3.1.2 重组质粒导入根癌农杆菌
• 3.2 农杆菌介导法转化水稻
• 3.3 抗性水稻植株的PCR 检测
• 3.3.1 转OsMAPK4 基因抗性植株的PCR 检测
• 3.4 PCR 阳性植株T1 代幼苗的BIALAPHOS 筛选及PCR 检测
• 3.4.1 T1 代幼苗Bialaphos 筛选
• 3.4.2 T1 代Bialaphos 筛选存活植株的PCR 检测
• 3.5 转PCME12 的PCR 阳性植株T1 代幼苗的耐盐性检测
• 3.5.1 种子发芽期NaCl 筛选压力的确定
• 3.5.2 转pCME12 PCR 阳性植株的T1 代种子耐盐性检测
• 3.6 目的基因转录的实时荧光定量PCR （REAL-TIME PCR）检测
• 3.6.1 RNA 的提取、纯化及RT-PCR 检测
• 3.6.2 引物筛选
• 3.6.3 目的基因转录的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测
• 3.7 转基因植株的转录组分析
• 3.7.1 准备实验材料送交芯片公司
• 3.7.2 芯片数据的初步分析
• 3.7.3 转录组表达差异分析
• 3.7.4 盐胁迫下水稻基因表达谱分析
• 4 讨论
• 4.1 RNAI 技术的应用
• 4.2 基因表达谱技术的应用
• 4.3 利用抗BIA 株系筛选T1 代转基因植株的可行性
• 4.4 转OSMAPK4 基因植株抗逆性提高的分子机理
• 5 结论
• 5.1 构建了植物表达载体PCMI
• 5.2 获得了转PCMI 和转PME12 水稻PCR 阳性植株
• 5.3 筛选得到抗BIALAPHOS 且PCR 检测呈阳性的T1 代植株
• 5.4 分析了转PME12T1 代水稻植株的耐盐性
• 5.5 检测了转基因植株在正常及盐诱导后OSMAPK4 基因的转录水平
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文