防风多糖的提纯、结构分析及生物活性研究

论文摘要

多糖是广泛存在于植物、动物、微生物组织中的一类天然高分子化合物,是维持生命正常运转的基本物质之一,具有抗氧化、抗衰老、调节免疫等多种生理活性,且无毒副作用,已被广泛应用于医药和保健食品领域。防风为伞形科多年生草本植物,是国家重点保护的野生药材之一。防风的药用部位主要是未抽花植株的干燥的根,具有解热、镇静、镇痛、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等多种生理功能,临床上被用来治疗伤风感冒、急性结膜炎、高血压、肥胖症、中风、痔疮等症,但其临床应用多以古代文献记载为依据,对其具体的活性成分和作用机制尚缺乏系统深入的研究。防风多糖是防风主要的活性成分之一,决定着其多项生理功能,因此对其进行深入系统的研究将能为防风资源的进一步开发利用提供必需的理论依据。本论文对防风多糖的提取、分离纯化、分子修饰、结构分析、生物活性等方面进行了比较系统的研究,主要实验结果如下:1.采用传统热水浸提法、超声强化提取法、微波辅助提取法三种不同方法提取防风多糖,优化出传统热水浸提法的最佳提取工艺为:提取温度75℃、固液比1:25、提取时间3h、提取次数3次:超声强化提取法的最佳提取工艺为:超声功率1000W、提取时间25min、固液比1:25;微波辅助提取法的最佳提取工艺为:微波功率560W、固液比1:30、提取时间10min。与传统热水浸提法相比,超声强化提取法和微波辅助提取法均可以提高防风多糖的提取率,其中以微波辅助提取法的效果更为明显,在最佳提取工艺条件下,微波辅助提取法的多糖提取率为7.639%,远高于传统热水浸提法的4.913%,而提取时间也由3h缩短到10min,大大节约了时间、降低了成本,因此微波辅助提取法是一种快速、高效的提取防风多糖的好方法。2.粗多糖经过脱色、除蛋白和柱层析分离纯化,得到两种防风多糖SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ,纯度鉴定结果表明SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ为均一的多糖。苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法分别测得SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ中的多糖和糖醛酸含量分别为93.1790%、71.0493%和6.4525%、29.1153%,高效液相凝胶色谱（HPGPC）法测得SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ的分子量分别为32700 Da和68100Da。利用气相色谱测得,SPS-Ⅰ中各种单糖组成的摩尔比为:鼠李糖:阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=0.80:9.34:1.42:3.98:7.40 SPS-Ⅱ中各种单糖组成的摩尔比则为:鼠李糖:阿拉伯糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=2.34:5.49:1.22:2.40:9.04。部分酸水解、高碘酸氧化和Smith降解实验结果表明,SPS-Ⅰ的主链是由Gal、Ara和Rha构成,Glu、Gal、Ara和Man构成侧链,而SPS-Ⅱ中,Gal、Ara、Glu和Rha除了构成主链组成外,还有一部分参与了侧链的构成。SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ的相邻糖残基间的连接方式以1→2、1→6、1→3等键型为主,少数以1→4键型连接,糖苷键以α-构型为主,而且表现出吡喃糖的特征吸收。3.防风多糖（SPS）经三氧化硫-吡啶法硫酸酯化得到硫酸酯化防风多糖（S-SPS）,得率为143.4513%,硫酸钡比浊法测得S-SPS的硫酸基含量为19.3853%,取代度DS为0.412。GC分析结果表明,SPS和S-SPS的单糖组成基本相同,均由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,只是各种单糖之间的比例略有差别。4.抗氧化实验结果表明,防风多糖具有一定的清除自由基、抗脂质过氧化的能力,对于不同的自由基,效果不尽相同,其中对·OH和DPPH·具有较强的清除作用,在SPS、SPS-Ⅰ、SPS-Ⅱ和S-SPS四种防风多糖中,以S-SPS和SPS-Ⅱ的效果较好,在8mg/mL时,二者对·OH的清除率均在90%以上。抑菌实验结果表明,防风多糖具有一定的抑菌性,并且对所抑菌的种类具有选择性,对青霉、毛霉和大肠杆菌无抑制作用,而对枯草芽孢杆菌的抑制效果较好。在几种防风多糖中,以S-SPS的效果最好,其对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为1mg/mL,远低于SPS的最小抑菌浓度（4mg/mL）。总之,防风多糖经硫酸酯化后,其水溶性和抗氧化活性明显提高,抑菌性能也有所增强,这可以为防风多糖的开发利用提供借鉴与参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.多糖
• 1.1 多糖概述
• 1.2 多糖的提取
• 1.2.1 溶剂提取法
• 1.2.2 酶法
• 1.2.3 超滤法
• 1.2.4 超声强化提取法
• 1.2.5 微波辅助提取法
• 1.2.6 超临界流体萃取法
• 1.3 多糖的分离与纯化
• 1.4 多糖的结构及结构分析
• 1.5 多糖的生物活性
• 1.5.1 免疫调节作用
• 1.5.2 抗肿瘤活性
• 1.5.3 抗病毒活性
• 1.5.4 抗衰老活性
• 1.5.5 抗凝血活性
• 1.5.6 抗辐射作用
• 1.5.7 抗炎活性
• 1.5.8 降血糖、降血脂作用
• 1.5.9 其它作用
• 1.6 多糖研究中存在的问题
• 1.7 多糖的应用及发展前景
• 2.防风
• 2.1 防风概述
• 2.2 防风的化学成分
• 2.2.1 挥发油
• 2.2.2 色原酮
• 2.2.3 香豆素
• 2.2.4 聚乙炔
• 2.2.5 有机酸
• 2.2.6 无机元素
• 2.2.7 多糖
• 2.2.8 其它
• 2.3 防风的药理作用及临床应用
• 2.4 防风多糖的生理活性
• 2.4.1 增强免疫的功能
• 2.4.2 抗肿瘤作用
• 3.本课题的立题背景、研究意义及主要研究内容
• 3.1 立题背景和研究意义
• 3.2 主要研究内容
• 第2章 防风多糖提取工艺的研究
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 原料的预处理
• 2.2 防风多糖提取方法的优化
• 2.2.1 传统热水浸提法
• 2.2.2 超声波强化提取法
• 2.2.3 微波辅助提取法
• 2.3 防风多糖提取率的计算
• 2.3.1 葡萄糖标准溶液的配制
• 2.3.2 苯酚试剂的配制
• 2.3.3 标准曲线的制作
• 2.3.4 样品提取率的测定
• 3.结果与分析
• 3.1 单因素分组实验结果与分析
• 3.1.1 传统热水浸提法单因素分组实验结果与分析
• 3.1.2 超声强化和微波辅助提取法单因素分组实验结果与分析
• 3.2 单因素实验方差分析
• 3.2.1 传统热水浸提法单因素实验方差分析
• 3.2.2 超声强化提取法单因素实验方差分析
• 3.2.3 微波辅助提取法单因素实验方差分析
• 3.3 正交实验结果与分析
• 3.3.1 传统热水浸提法正交实验结果与分析
• 3.3.2 超声强化提取法正交实验结果与分析
• 3.3.3 微波辅助提取法正交实验结果与分析
• 3.4 不同提取方法效果对比
• 4.结论
• 第3章 防风多糖的分离纯化及理化性质分析
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 防风多糖的脱色
• 2.2 防风多糖的除蛋白
• 2.3 防风多糖的纯化
• 2.3.1 DEAE-52纤维素柱层析
• 2.3.2 Sephadex G-200柱层析
• 2.4 防风多糖的纯度鉴定
• 2.4.1 紫外光谱分析
• 2.4.2 凝胶柱层析
• 2.4.3 比旋光度测定
• 2.5 防风多糖的理化性质分析
• 2.6 防风多糖的多糖及糖醛酸含量测定
• 2.6.1 多糖含量测定
• 2.6.2 糖醛酸含量测定
• 2.7 防风多糖的相对分子量测定
• 3.结果与分析
• 3.1 防风多糖的脱色、除蛋白结果
• 3.2 防风多糖（SPS）的DEAE-52柱层析结果
• 3.3 Sephadex G-200柱层析结果
• 3.4 SPS-Ⅰ和SPS-Ⅱ的纯度鉴定结果
• 3.4.1 紫外光谱扫描结果
• 3.4.2 凝胶柱层析结果
• 3.4.3 比旋光度测定结果
• 3.5 SPS-Ⅰ和SPS-Ⅱ的理化性质分析结果
• 3.6 多糖及糖醛酸含量测定结果
• 3.7 相对分子量测定结果
• 4.结论
• 第4章 防风多糖的硫酸酯化及结构分析
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 硫酸酯化防风多糖（S-SPS）的制备
• 2.2 S-SPS的定性判断
• 2.3 S-SPS中硫酸基含量及取代度的测定
• 2.3.1 标准曲线的绘制
• 2.3.2 换算因子（f）的测定
• 4^2-含量的测定'>2.3.3 样品中SO₄^2-含量的测定
• 2.3.4 样品中硫酸基取代度（DS）的计算
• 2.4 防风多糖的单糖组成分析
• 2.4.1 单糖衍生物的制备
• 2.4.2 多糖样品的水解和衍生化
• 2.4.3 气相色谱（GC）分析
• 2.5 防风多糖的结构分析
• 2.5.1 红外光谱（IR）分析
• 2.5.2 三氟乙酸部分（TFA）酸水解
• 2.5.3 高碘酸氧化和Smith降解
• 3.结果与分析
• 3.1 防风多糖硫酸酯化结果
• 3.2 S-SPS的光谱学鉴定结果
• 3.3 防风多糖的单糖组成分析结果
• 3.4 防风多糖的红外光谱分析结果
• 3.5 防风多糖部分酸水解结果与分析
• 3.6 防风多糖高碘酸氧化和Smith降解结果与分析
• 4.结论
• 第5章 防风多糖的生物活性研究
• 1.材料和仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2.实验方法
• 2.1 防风多糖的抗氧化实验
• 2.1.1 总还原力测定
• 2^-·）能力测定'>2.1.2 清除超氧阴离子自由基（O₂^-·）能力测定
• 2.1.3 清除羟自由基（·OH）能力测定
• 2.1.4 清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）能力测定
• 2+诱发的脂质过氧化反应的抑制作用'>2.1.5 对Fe²⁺诱发的脂质过氧化反应的抑制作用
• 2.2 防风多糖的抑菌实验
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 菌种活化及菌悬液的制备
• 2.2.3 防风多糖溶液的配制
• 2.2.4 防风多糖的抑菌作用测定
• 2.2.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 3.结果与分析
• 3.1 防风多糖的抗氧化实验结果及分析
• 3.1.1 还原力测定结果及分析
• 2^-·）的清除作用'>3.1.2 对超氧阴离子自由基（O₂^-·）的清除作用
• 3.1.3 对羟自由基（·OH）的清除作用
• 3.1.4 对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）的清除作用
• 2+诱发的脂质过氧化反应的抑制作用'>3.1.5 对Fe²⁺诱发的脂质过氧化反应的抑制作用
• 3.2 防风多糖的抑菌实验结果及分析
• 3.2.1 防风多糖对四种常见食品微生物的抑制作用
• 3.2.2 防风多糖对枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）
• 4.结论
• 第6章 总结及展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果