论文摘要
前期工作已经测定了苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）菌株YBT-1520的基因组序列及其11个质粒的拷贝数,发现质粒的拷贝数与分子量呈负相关（除个别以外）,质粒的DNA含量大于染色体的DNA含量,通过测定最小质粒pBMB2062在不同宿主中的拷贝数发现,其在不同宿主中拷贝数是不一样的。由于以上的11个质粒的复制区是各不一样的,那么在同一个复制区的情况下,大小不同的质粒拷贝数又会有什么变化呢?本研究以苏云金芽胞杆菌YBT-1520中的95kb质粒pBMB95的复制区ori60为研究对象,测定其携带不同大小DNA片段的重组质粒的分离稳定性,主要工作内容如下：1.苏云金芽胞杆菌复制区ori60携带不同大小外源片段的重组质粒的构建从实验室已经构建苏云金芽胞杆菌的基因组BAC文库中去筛选大小不同的质粒,并通过载体置换的方式把大肠BAC载体置换成穿梭载体pEMB0557,最终得到一系列的大小不同外源片段的重组质粒：pBMB10 （10 kb）, pBMB19 （19 kb）, pBMB36 （36 kb）, pBMB45 （45 kb）, pBMB55 （55 kb）, pBMB75 （75 kb）, pBMB85（85 kb）。将这些重组质粒转化到无晶体突变株BMB171,得到的重组菌株分别命名为BMB010, BMB019, BMB036, BMB045, BMB055, BMB075, BMB085。2.重组质粒在不同温度以及不同培养基培养条件下质粒分离稳定性的测定选择3个不同的温度（20℃,28℃,37℃）对分别转化了质粒大小为19 kb,55 kb,85 kb的3株重组菌株BMB019, BMB055, BMB085进行培养,并进行质粒分离稳定性的测定。以重组菌株BMB019为例,28℃以及20℃培养条件下传代100代后,质粒的分离稳定性下降10%,而在37℃条件下培养传代100代,质粒的分离稳定性下降90%,高温对质粒的分离稳定性有负作用。选用4种常用的芽胞杆菌培养基分别为：LB培养基、T3培养基、葡萄糖酵母提取物培养基（glucose-yeast extract）和NYS/CAA培养基,对重组菌株进行培养,并检测质粒的分离稳定性。以重组菌株BMB019为例,在LB培养基培养条件下,传代100代后,质粒的分离稳定下降10%；在T3培养基培养,传代100代后质粒的分离稳定性下降80%；最差的是葡萄糖酵母提取物培养基（glucose-yeast extract medium）和NYS/CAA培养基,传代100代后质粒的分离稳定性下降95%。对培养基的成分分析可知,可以看出培养基中的矿物盐离子的种类以及有机营养物质的含量对质粒的分离稳定性都有一定的影响。矿物盐离子的种类对质粒的分离稳定性有负作用,而有机营养物质的含量与质粒分离稳定性有正作用。3.重组质粒的拷贝数和分离稳定性测定通过real time-qPCR对构建的重组质粒进行拷贝数的测定,发现重组质粒大小与拷贝数之间呈现负相关性,且这种负相关性呈现线性关系,之前对0型复制方式的复制子尚无此方面的报道。通过质粒分离稳定性的实验,发现重组质粒大小与质粒分离稳定性之间呈现负相关性,而这种负相关性是非线性的,成倒S型曲线,这种相关的研究还未见报道。4.控制质粒pBMB28分离稳定性的因子的定位通过染色体步法,从YBT-020菌株的基因组文库,筛选了4个可以完整覆盖质粒pBMB28的片段,转化BMB171。本研究对得到四株重组菌株分别进行质粒分离稳定性的测定,发现其中两个重组质粒pBMB625和pBMB721分离稳定性为100%。我们以pBMB625为研究对象,通过截短实验,确定了质粒稳定性相关的因子在9kb的DNA片段上,对这9 kb的序列进行Blast分析以及氨基酸同源性分析,推测其可能是一种新的质粒分离稳定系统。本研究通过测定了重组质粒的拷贝数和不同生长条件下质粒分离稳定性,以及控制质粒分离稳定因子的寻找,让我们对质粒的拷贝数和分离稳定性有了新的认识。