基于核糖体基因以及线粒体基因对大熊猫等21种野生动物寄生蛔虫的种系发育分析

论文摘要

大熊猫、小熊猫、熊类、犬科和猫科等中的很多动物都是我国珍稀的野生动物,是我们保护的重点对象。对动物园野生动物感染寄生虫的调查报告显示,蛔虫是这些动物感染率高,感染程度严重的主要寄生虫。长期以来,蛔虫的分类主要以形态结构特征为主要依据,但由于宿主与地理环境等因素所导致的遗传变异,传统的形态与生物学分类研究方法在一些蛔虫近缘种的分类鉴定中的局限性日益明显,仍然存在对一些姊妹种的鉴定出现错误。近年来随着分子生物学的发展,越来越多的分子生物技术应用到对蛔虫的分类研究上,尤其是利用线粒体和核糖体上的基因对蛔虫的分类。为进一步研究大熊猫等21种野生哺乳动物体内寄生的蛔虫的分类关系,本次试验选用了变异程度不同的核糖体上18s、28s和线粒体上12s、cytb基因进行分析,以期为蛔虫的分类提供新的依据。所获得研究结果和结论如下：1基于核糖体18SrDNA、28SrDNA基因和线粒体12SrDNA基因序列对大熊猫等21种野生哺乳动物蛔虫的分析为了探讨大熊猫、小熊猫、黑熊、棕熊、马熊、北极熊、黑猩猩、白颊长臂猿、猕猴、金猫、豹猫、丛林猫、孟加拉虎、东北虎、华南虎、白虎、非洲狮、猞猁、蓝狐、银狐和狼共21种珍稀野生动物体内寄生蛔虫的分类地位,利用PCR方法对这些动物体内寄生蛔虫的核糖体18S,28S以及线粒体上12S三个基因的部分序列进行测定,各得到了21条序列。对测得蛔虫的三个基因序列进行互对比较。结果表明包含有五大种群,即猫弓首蛔虫种群（金猫、豹猫和丛林猫）,犬弓首蛔虫种群（银狐、蓝狐）,狮弓蛔虫种群（孟加拉虎、东北虎、华南虎、白虎、非洲狮、猞猁、狼）,贝蛔虫种群（黑熊、棕熊、马熊、北极熊、大熊猫、小熊猫）以及蛔属蛔虫种群（黑猩猩、白颊长臂猿和猕猴）。对序列进行分析结果显示,经比对校正后的18S的长度为1708bp,21种野生动物感染蛔虫18S基因序列的同源性为98.5%-100%；校正后的28S的长度为751bp,28S基因在狮弓蛔虫种群和猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫种群间的差异度分别为14.9%～15.8%和147%-15.1%,在其他种群间差异较小,而在种群内,28S差异性很小；校正后的12s序列长度为499bp,猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫两个种群间12s基因序列差异度为11.7％～12.8%,狮弓蛔虫种群与猫弓首蛔虫种群和犬弓首蛔虫种群间的差异度分别为21.4%-23.4%和20.3%-21.4%,12S基因在贝蛔属种群和蛔属种群内差异较小。可见12S基因在种内种间都有一定的差异性。利用不同的方法对rDNA （18S+28S）,12S和三个基因组合（rDNA+12S）后的数据构建进化树,得到了近似一致的拓扑结构。从系统进化树来看,弓首亚科和蛔亚科作为单系群都受到了较高的支持,在各个分支的节点都有较高的支持率。蛔亚科中弓蛔属在不同的树中的地位有所不同,且不同的树中弓蛔属的自展值都较低,其分类地位有待进一步研究。在贝蛔属中,大熊猫、小熊猫以及四种熊科动物感染的蛔虫亲缘关系较近。2对大熊猫,小熊猫,熊科动物和灵长类动物感染蛔虫的cytb基因的分析为了进一步探讨贝蛔属和蛔属各种间之间的亲缘关系,对大熊猫、小熊猫、北极熊、黑熊、浣熊和猕猴感染的蛔虫的cytb基因进行分析,以异尖线虫为外源群,结合已公布的弓首属蛔虫序列,分别构建构建NJ/MP/ML树,序列结果分析显示：经过人工校对后的序列长度为877bp,其中变异位点382个,简约信息位点267个,密码子的第三位点的突变率最高。cytb基因表现出较高的A+T偏向。系统进化树的结果显示,小熊猫贝蛔虫的亲缘关系明与熊科动物感染的转移贝蛔虫的亲缘关系近于大熊猫感染的西氏贝蛔虫的亲缘关系,而浣熊贝蛔虫的进化距离比上述三种蛔虫的进化距离长。猕猴感染的蛔虫与猪蛔虫的亲缘关系相当近。实验表明：cytb基因具有较高的突变率,在种内至种属间的分类关系是一个良好的标记基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 一、大熊猫等野生动物生存现状
• 1 各科动物感染的蛔虫及危害
• 1.1 大熊猫
• 1.2 小熊猫
• 1.3 黑猩猩等灵长类动物
• 1.4 熊科
• 1.5 犬科和猫科动物
• 二 分类学研究概况以及常用的遗传标记基因
• 1 大熊猫、小熊猫、熊科、猫科和犬科动物寄生蛔虫的分类学的研究概况
• 1.1 大熊猫、小熊猫、熊科动物和黑猩猩等灵长类动物寄生蛔虫分类学研究
• 1.2 犬科和猫科动物寄生的蛔虫分类学研究
• 2 核糖体18SrDNA、28SrDNA基因以及线粒体12srDNA、cytb基因研究进展
• 2.1 核糖体大小亚基18s,28s的研究
• 2.2 线粒体小亚基12s基因的研究
• 2.3 线粒体Cytb基因的研究
• 三 研究目的与意义
• 第二部分 研究内容
• 第一章 基于核糖体18SrDNA、28SrDNA基因和线粒体12SrDNA基因序列对大熊猫等21种野生哺乳动物蛔虫的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验样品
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 主要生物信息学数据库和计算机软件
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 虫体总DNA的提取与纯化
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 PCR反应扩增体系及程序
• 1.2.4 PCR产物的回收与纯化
• 1.2.5 序列比对,分析序列差异性
• 1.2.6 序列特征
• 1.2.7 系统进化树的构建
• 2 实验结果
• 2.1. 序列特征
• 2.2 大熊猫等21种野生哺乳动物感染蛔虫的18s、28s和12s三个基因序列分析
• 2.2.1 核糖体18s基因序列分歧度以及相似性分析
• 2.2.2 核糖体28s基因序列分歧度以及相似性分析
• 2.2.3 线粒体12s基因分歧度以及相似性分析
• 2.3 分子系统进化树的构建与分析
• 2.3.1 多基因不一致水平检验
• 2.3.2 系统进化树的构建
• 2.3.2.1 基于rDNA数据构建的系统进化树
• 2.3.2.2 基于12s数据构建的系统进化树
• 2.3.2.3 基于三个基因组合数据构建的系统进化树
• 3 讨论
• 3.1 基因变异性
• 3.2 种群分类鉴定
• 3.2.1 贝蛔属种群
• 3.2.2 蛔属种群
• 3.2.3 狮弓蛔虫种群
• 3.2.4 弓首蛔虫种群
• 3.3 系统进化分析
• 3.3.1 蛔亚科
• 3.3.2 弓首亚科
• 4 小结
• 第二章 对大熊猫等6种动物感染蛔虫的cytb基因的分析
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 蛔虫虫体总DNA的提取
• 1.2.2 蛔虫cytb基因PCR扩增及测序
• 1.2.3 序列比对分析以及系统进化分析
• 2 实验结果与分析
• 2.1 6种野生动物感染蛔虫的序列特征
• 2.2 系统进化树的构建
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三部分 结论和创新点
• 1.结论
• 1.1 基于12s、18s和28s基因对大熊猫等21种野生哺乳动物感染的蛔虫的分子分类研究
• 1.2 基于cytb基因对大熊猫等6种野生动物感染蛔虫的分子分类研究 #472 创新点
• 2 创新点
• 参考文献
• 致谢