鸡wdr72基因的离体克隆表达和体内表达特征

论文摘要

wdr72是本文课题组筛选的蛋壳强度相关的一个新基因，具体生化功能及生物学特性均未见报道。本文提取蛋鸡子宫组织，克隆wdr72的全长编码基因；用原核载体对wdr72的C端（3’端）序列进行诱导表达并纯化获得重组蛋白、制得其多抗；此外，本文还利用qRT-PCR研究wdr72基因在蛋鸡各个组织器官中，蛋壳形成过程中鸡产道中的表达规律。1)克隆wdr72全长编码基因：提取蛋鸡子宫组织总RNA并反转录。参照GenBank中原鸡（G. gallus）wdr72基因序列，设计3对引物，（分别对应1-970bp、877-2172bp、2111-2784bp）。从鸡子宫cDNA中PCR克隆上述3个基因片段，测序正确后，连接到真核表达质粒pEGFP-N1中，得到wdr72全长基因2)原核表达wdr72的C端（3’端）序列：将wdr72的C端（3’端）序列（1984-2784bp）构建到原核表达质粒pET28b中，获得wdr72的C端编码基因的原核表达重组子。经过优化，在37℃用0.4mM IPTG诱导得到了包涵体形式表达的产物。3)纯化WDR72的C端（3’端）肽链：用8M尿素溶解后，将重组蛋白过镍柱，然后用500mM咪唑梯度洗脱获得大量较高纯度的WDR72-C重组蛋白，并用其制作多克隆抗体。4)采集蛋鸡的肝、心、脾、肺、胃、肠、肾、脑、胸肌以及输卵管、白峡、子宫等产道组织。另外通过观测蛋鸡的蛋壳品质及其产蛋规律，分别在蛋清形成阶段、壳膜形成阶段、初始矿化阶段、快速矿化阶段、快速矿化后期采集产道组织。提取RNA后并反转录后，利用荧光定量PCR法比较分析wdr72基因的表达特点，结果表明该基因主要表达在产道组织中，其中又以子宫组织最多，另外wdr72在壳膜形成阶段及快速矿化阶段有着活跃的表达。总之，本文克隆并构建了wdr72全长编码基因的原核表达重组质粒；表达并纯化了WDR72-C端肽链序列，并制备了WDR72多抗；揭示了wdr72在蛋鸡体内的表达规律及其与蛋壳形成的关联性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 选题背景与研究现状
• 1.1.1 蛋壳品质研究的意义
• 1.2 蛋壳的结构与形成过程
• 1.2.1 蛋壳的结构
• 1.2.2 蛋壳的形成过程
• 1.3 蛋壳品质的研究现状
• 1.3.1 蛋壳的质量评价机制
• 1.3.2 有机基质对蛋壳形成的调控作用
• 1.3.3 蛋白质对蛋壳形成的调控机制
• 1.4 wdr72 基因的研究现状
• 1.5 荧光定量 PCR
• 1.5.1 荧光定量 PCR 原理
• 1.5.2 荧光定量 PCR 的特点
• 1.5.3 荧光定量 PCR 的应用
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 蛋鸡 wdr72 全长编码基因克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.2. 结果与分析
• 2.2.1 PCR
• 2.2.2 重组质粒鉴定
• 2.2.3 家鸡 wdr72 基因的核苷酸突变位点
• 2.2.4 wdr72 基因进化分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 对 GenBank 预测序列的验证
• 2.3.2 酶切条件优化
• 2.3.3 感受态细胞效率的提高
• 2.3.4 重组子大小异常分析
• 2.3.5 wdr72 进化分析
• 第三章 鸡 wdr72C 端基因的原核表达纯化与多抗制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 转化
• 3.2.2 表达条件探索
• 3.2.3 挑菌接种，用 IPTG 诱导
• 3.2.4 检测目的蛋白可溶性
• 3.2.6 镍柱纯化目标蛋白
• 3.2.7 目的蛋白浓缩与检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 蛋白质诱导条件优化
• 3.3.2 目的蛋白可溶解性检验
• 3.3.3 目的蛋白的纯化
• 3.3.4 抗体制作
• 3.4 讨论
• 3.4.1 融合蛋白表达条件探索
• 3.4.2 目的蛋白纯化方法的探索
• 3.4.3 目的蛋白复性
• 3.4.4 菌株与载体选择
• 3.4.5 N 端与 M 段的表达情况
• 第四章 蛋鸡 wdr72 基因表达特征
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验试剂与耗材
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验物品处理
• 4.2 实验过程
• 4.2.1 蛋鸡准备
• 4.2.2 RNA 提取
• 4.2.3 反转录
• 4.2.4 实时荧光定量 PCR
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 组织采集情况
• 4.3.2 RNA 提取
• 4.3.3 Realtime PCR 结果的准确性
• 4.3.4 wdr72 时空表达分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 避免基因组 DNA 污染
• 4.4.2 内参基因
• 4.4.3 荧光定量 PCR 与普通 PCR 方法的比较
• 4.4.4 采样准确度
• 4.4.5 wdr72 基因对蛋壳品质的影响
• 4.4.6 wdr72 组织表达差异
• 4.4.7 wdr72 的时空表达分析
• 4.4.8 wdr72 功能分析
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 致谢