论文摘要
犬瘟热（Canine distemper CD）系由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒引起犬科、鼬科等多种食肉动物的一种急性、热性、高度接触性的传染病，分布范围广，易感动物种类多，发病率和死亡率高。自发现以来，犬瘟热一直未停止对动物健康的威胁。截至目前，世界各国凡是有犬科动物生存的地区都有本病发生，即使美、英、法、澳大利亚、新西兰、日本等动物卫生水平较高的发达国也不例外，我国自1968年首次在黑龙江一野生动物饲养场发现犬瘟热，现已蔓延到吉林、辽宁、江苏、四川、山东、广西等二十几个省区。犬瘟热的流行与传播严重地影响了经济动物养殖、野生动物保护和动物贸易的健康发展。随着CDV对动物流行因素的不断适应，其自然感染宿主范围在不断扩大，加之CDV变异株的出现，犬瘟热的发病率和致死率仍居高不下，流行趋势由散发向群发发展，临床症状越来越复杂，其危害也越来越大。特别是国宝大熊猫等珍稀动物及猕猴等灵长类动物的CDV感染，使CDV的致病地位日益突出。此外，最新研究证实CDV在体外可感染人的前体破骨细胞，在破骨细胞内增殖，表明CDV的自然宿主可能已扩展到了人类，犬瘟热可能是犬传染给人的第二个病毒性传染病。鉴于上述因素，国际动物卫生组织（OIE）始终将其作为重点关注的疫病之一，我国也在CD的诊断、防治等领域进行大量的研究。本研究由国家质检总局资助，在口岸动物检疫特种经济动物重点试验完成，旨在收集关于CD疫情信息、跟踪研究进展、开发诊断技术、分析流行趋势，为进一步研究防治措施、完善标准体系奠定基础，主要包括以下内容：1．狐源犬瘟热病毒的分离与鉴定本研究用MDCK细胞从具有疑似犬瘟热症状的病狐血液中分离到一株病毒，该病毒在MDCK细胞上生长良好，并能形成典型而规律的CPE。经电镜观察、理化特性、滴度测定、动物回归试验、RT-PCR和荧光定量RT-PCR鉴定，证实分离到的病毒为一株犬瘟热病毒强毒株，并命名为CDV-FOX-TA。该病毒的分离与鉴定的成功，为进一步开展狐狸犬瘟热的综合性防制和诊断技术研究奠定了基础，具有重要的理论价值和实践意义。2．根据Genbank上发表的犬瘟热病毒（CDV）N基因核酸序列，设计、合成一对CDV N基因特异性引物，并在上下游引物分别引入酶切位点Kpn I／XhoI，采用RT-PCR扩增出狐源CDV泰安分离株（CDV-FOX-TA）的N基因片段，纯化扩增的N基因后，将其克隆入pMD18-T载体。进行测序分析，证实CDV-FOX-TA N基因含有1个ORF，全长1572bp，共编码523个氨基酸，N蛋白含有高度保守Tyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe九肽序列，是T细胞表位，可致敏靶细胞。CDV-FOX-TA N基因与CDV疫苗株Ondersteport、Convac的N基因的同源性分别为96.0％和95.9％，与CDV野毒株N基因的同源性在98.4％-98.9％之间。对CDV N基因进行系统发生分析，结果发现CDV-FOX-TA与CDV强毒株的亲缘关系较为密切。3．根据GenBank发表的犬瘟热病毒N基因全序列，设计合成了1对特异扩增CDV N基因的引物。以山东泰安分离的CDV-FOX-TA株细胞毒中提取病毒RNA来制模板，利用RT-PCR扩增出了1.6kb的N基因，将其克隆到pIREShyg载体上，构建了pIRES-N真核表达载体。然后通过脂质体转染CHO-K1细胞，用潮霉素筛选得到阳性克隆。间接免疫荧光实验（IFA）鉴定N基因在CHO细胞中的表达，RT-PCR方法则从转录水平证实N基因在CHO-K1细胞中的表达。CHO／CDV-N细胞株的成功构建，为进一步研究犬瘟热血清学检测技术和基因疫苗奠定了基础。4．RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒（CDV）核衣壳（N）蛋白基因的高度保守序列后，将其TA克隆至pMD18-T载体中，再将测序正确的N基因的目的片段亚克隆到原核表达载体pET24b中6×His Tag编码基因的上游，并将该重组质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3）株，经IPTG诱导，N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE分析和Western blot分析的结果显示，表达产物的分子质量为15 kD，与CDV标准阳性血清呈阳性反应，间接ELISA结果也表明重组表达产物具有良好的抗原性，能够有效区分CDV标准阳性与阴性血清，表明大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上具有与天然N蛋白一定的相似性，可作为诊断用抗原，为下一步建立检测CDV的间接ELISA试剂盒奠定了基础。5将构建好的含重组质粒且能正确表达N蛋白的Rosetta 2（DE3）菌株中，在最佳诱导条件下获得重组N蛋白。随后用镍亲和层析方法对表达产物进行纯化，对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测。在此基础上，以纯化的重组N蛋白作为包被抗原，对各种条件进行优化（如抗原的包被，作用时间），确定了判定标准，建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法。用此方法检测了270份血清样品，并与法国Synbiotics公司ELISA试剂盒检测结果相比较，符合率达92.4％。6．实验选择CDV的M基因保守序列作为引物和探针并对CDV RT-PCR和Taq Man荧光定量RT-PCR的反应体系和反应条件进行了优化，建立了CDVTaq Man荧光定量RT-PCR检测cdv技术。利用检测系列稀释的标准阳性样品建立标准曲线，可对待检样品中病毒含量定量，精确度可达0.01 TCID50／ml，敏感性比常规的RT-PCR的方法高100倍；对Rabies virus、CPV、CAV-1和CAV-2进行检测不产生扩增，具有高度特异性。CDV TaqMan荧光定量RT-PCR方法在检测CDV整个过程中从RNA提取到出现检测结果只需3小时，检测时间大大缩短。本法既可对血液、扁桃体等体内样品中检测病毒，又可对尿液、结膜拭子、粪拭子等体外样品进行检测，样品收集不受限制，微量样品也可进行检测，而且本法一次可检测多个样品，检测通量高。应用结果表明，TaqMan荧光定量RT-PCR与RT-PCR和电镜观察的符合率高，具有准确定量、灵敏度高和特异性强、降低污染以及省时省力等优点，且提取RNA后完全是自动的，大大减少手工操作、降低实验室污染机会，实用性较强。