论文题目: 糖基化磷脂酰醇（GPI）锚定型人B7-1基因重组蛋白锚定自体肿瘤细胞膜对提高CTL杀伤泌尿系统肿瘤细胞的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 泌尿外科学
作者: 张淑敏
导师: 畅继武
关键词: 肿瘤免疫,糖基化磷脂酰肌醇,共刺激因子,蛋白转移,疫苗
文献来源: 天津医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 肿瘤免疫过程主要由T淋巴细胞介导,而T淋巴细胞的活化需要两个信号系统,第一信号由T淋巴细胞受体(TCR)与抗原肽-MHC复合物相结合所提供,第二信号由辅助分子或共刺激分子通过与T细胞上相应受体结合而传递。缺乏共刺激信号,T淋巴细胞进入无反应状态,或发生程序性死亡。B7-1是肿瘤免疫过程中重要的共刺激因子之一,它通过与T细胞表面的CD28受体结合介导第二信号,协同由于CR介导的第一信号,共刺激T细胞增殖并产生多种淋巴因子,促进并协调免疫反应的发生。许多肿瘤细胞因缺乏共刺激因子的表达而获得免疫逃避,因此将B7-1与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白融合,利用GPI锚定功能将B7-1靶向锚定在肿瘤细胞膜表面,这种B7-1修饰的肿瘤细胞膜可同时提供抗原特异性的第一信号和共刺激信号,有效激发CD4~+,CD8~+细胞及NK细胞的增殖和活化,能抵御非修饰肿瘤细胞侵袭,一定条件下能降低肿瘤的复发和转移。 糖基化磷脂酰肌醇(GPI)蛋白是一种细胞表面膜蛋白,通过GPI结构锚定于细胞表面,而不跨越其磷脂膜双层结构,亦无胞内区。GPI蛋白可以被去污剂由细胞表面洗脱,以假微团形式存在于溶液中,当再次与靶细胞或细胞膜共同浮育时,可自动整合至细胞膜表面,并恢复其原有功能。 本项研究依据肿瘤免疫过程中共刺激因子B7的作用,和GPI锚定信号的理论和方法,利用分子生物学手段,将B7胞外区编码序列同天然GPI蛋白衰变加速因子(DAF)C端编码34个氨基酸的锚定信号的基因序列重组,将重组基因插入真核表达载体pCDNA3,构建表达载体pCDNA3-GPI-B7-1,与质粒pSV2-dhfr共转染CHO/DHFR~-细胞,经G418筛选和MTX加压,筛选出稳定表达目的蛋白的细胞株,目的蛋白GPI·B7-1分离纯化后,经Western
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
实验材料与方法
主要材料和试剂
实验方法
第一部分 糖基化磷脂酰肌醇锚定型人共刺激因子B7-1表达质粒的鉴定及其对CHO／DHFR~-细胞的转染
1.1 GPI·B7-1表达质粒pCDNA3-GPI-B7-1的酶切鉴定
1.2 质粒pSV40-DHFR的扩增和酶切鉴定
1.3 脂质体介导的pCDNA3-GPI-B7-1和pSV40-DHFR双质粒共转染CHO／DHFR~-细胞
第二部分 目的蛋白GPI·B7-1在CHO／DHFR~-细胞中的稳定表达
2.1 流式细胞术检测目的蛋白的表达
2.2 直接免疫荧光染色检测目的蛋白表达
2.3 GPI锚定蛋白的检测(用糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PIPLC)对目的蛋白进行洗脱
第三部分 目的蛋白GPI·B7-1的分离提取和对小鼠前列腺癌细胞(RM-1)细胞膜的锚定
3.1 GPI·B7-1蛋白的分离提取
3.2 提取的膜蛋白的浓度检测
3.3 Western Blot检测目的蛋白的活性
3.4 GPI·B7-1对RM-1小鼠前列腺癌细胞细胞膜的锚定
第四部分 糖基化磷脂酰肌醇锚定型人共刺激因子B7-1对小鼠的免疫和肿瘤负荷研究
4.1 小鼠的免疫和免疫系统功能检测
4.2 小鼠的肿瘤接种实验
结果
第一部分 糖基化磷脂酰肌醇锚定型人共刺激因子B7-1表达质粒的鉴定及其对CHO／DHFR~-细胞的转染
1.1 质粒pCDNA3-GPI-B7-1和pSV40-DHFR的酶切鉴定
1.2 细胞对G418敏感性的测定
1.3 脂质体介导的基因转染
第二部分 目的蛋白GPI·B7-1在CHO／DHFR~-细胞中的稳定表达
2.1 流式细胞术检测目的蛋白的表达
2.2 直接免疫荧光染色检测目的蛋白的表达
2.3 GPI锚定蛋白的检测
第三部分 目的蛋白GPI·B7-1的分离提取和对小鼠前列腺癌细胞(RM-1)细胞膜的锚定
3.1 GPI·B7-1蛋白的分离提取和Western Blot
3.2 ELISA检测GPI·B7-1蛋白对肿瘤细胞膜的锚定
第四部分 糖基化磷脂酰肌醇锚定型人共刺激因子B7-1对小鼠的免疫和肿瘤负荷研究
4.1 小鼠的免疫系统功能检测
4.2 小鼠荷瘤试验结果
讨论
小结
参考文献
图片
致谢
综述
质粒载体图
发布时间: 2005-09-13
参考文献
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标签：肿瘤免疫论文; 糖基化磷脂酰肌醇论文; 共刺激因子论文; 蛋白转移论文; 疫苗论文;