体外共培养体系在猪卵母细胞核质同步成熟、受精以及胚胎发育中的研究

论文摘要

以体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)为基础的哺乳动物体外生产(IVP)技术已经成为现代农业与生物医学领域中的一项重要技术。然而与其它动物相比,猪IVP过程中卵母细胞核质同步成熟度不足、多精受精以及胚胎发育能力较低的问题一直没有得到有效解决。为进一步提高猪卵母细胞的成熟质量,降低多精入卵的发生并提高猪胚胎的体外发育能力,本试验研究了体外共培养体系对猪卵母细胞体外核质同步成熟、体外受精以及猪早期胚胎体外培养(IVC)的影响。重点比较了猪巢皮质细胞(porcine ovarian cortex cells, pOCCs)猪卵泡颗粒细胞(porcine follicular granule cells, pFGCs )、猪输卵管上皮细胞(porcine oviductal epithelial cells, pOECs )以及猪卵丘细胞(porcine cumulus cells, pCCs)单层参与的共培养体系在IVM、IVF以及IVC中不同作用。本研究首次将pOCCs单层共培养体系引入猪卵母细胞IVM领域,对pOCCs单层在猪卵母细胞核质同步发育上的协调能力进行研究,并获得成功。通过对IVM、IVF以及IVC过程中共培养体系的研究,以期有效提高猪卵母细胞在IVM中的核质同步发育程度、降低多精入卵率,并提高猪胚胎的体外发育能力,为猪类及其它哺乳类动物遗传资源的开发与利用进一步奠定一定的研究与应用基础。结果表明:1.在猪卵母细胞IVM中使用PMSG、hCG以10IU/ml为宜,高浓度的激素对第一极体(PbⅠ)的排出无明显影响(46.1 vs. 43.5, P>0.05),且高浓度的激素不利于卵丘细胞在IVM中扩散;MⅡ期卵母细胞在激素作用22 h与44 h之间无显著差异(64.6 vs. 61.8, P>0.05)。2. pOCCs单层、pOECs单层与pFGCs单层在IVM中共培养均可以显著提高猪卵母细胞的核成熟(P<0.05),但是pOCCs的促成熟效果最为显著(80.8 vs. 70.2, 74.1, P<0.05);pOCCs单层与pFGCs单层在IVM中共培养可以显著增加猪成熟卵母细胞内谷胱苷肽(GSH)的含量,且pOCCs优于pFGCs(8.1 vs. 7.0, P<0.05);三种共培养体系可显著增加猪成熟卵母细胞在IVF后的雄原核(PMN)形成率(P<0.05),但三者间差异不显著(P>0.05);皮质颗粒细胞(CGs)在pOCCs与pFGCs共培养组内猪成熟卵母细胞中有明显的迁移现象。3. IVM中pOCCs与pOECs组内猪卵母细胞在IVF后的多精入卵率显著降低(39.9, 41.7 vs. 46.1,P<0.05),但pFGCs组内猪卵母细胞的多精入卵率没有得到有效改善(P>0.05);IVM中pOCCs单层、pOECs单层与pFGCs单层共培养可有效提高IVF后猪囊胚发育率(22.6, 20.5, 20.1 vs. 14.0, P<0.05),但三者之间无显著性差异(P>0.05)。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 猪卵母细胞的体外成熟研究进展
• 1 哺乳动物卵泡与卵母细胞的发生与生长发育
• 1.1 卵泡、卵母细胞的发生与成熟分裂的开始
• 1.2 卵泡、卵母细胞的生长发育与卵母细胞的成熟分裂
• 2 卵母细胞成熟过程中调节机制
• 3 猪卵母细胞的体外成熟
• 3.1 卵母细胞的核成熟
• 3.2 卵母细胞的质成熟
• 3.3 IVM 中影响卵母细胞核质发育的因素
• 3.3.1 激素对卵母细胞成熟的影响
• 3.3.2 生长因子对卵母细胞成熟的影响
• 4 卵母细胞成熟体系的发展
• 第二章 猪卵母细胞的体外受精研究进展
• 1 精子的获能（capacitation）与顶体反应（acrosomal reaction,AR）
• 2 精子体外获能的方法
• 2.1 精子的洗涤
• 2.2 血清白蛋白
• 2.3 肝素与咖啡因
• 2.4 钙离子载体
• 3 多精入卵
• 3.1 CGs、透明带与多精入卵
• 3.2 精子密度、受精时间与多精入卵
• 3.3 其它添加物与多精入卵
• 4 体外受精体系的发展
• 5 猪胚胎的体外培养（In vitro culture, IVC）
• 试验研究
• 第三章 体外共培养体系对猪卵母细胞核质同步成熟的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 猪卵巢与卵母细胞的选择
• 1.2 各类培养基及试剂
• 1.3 共培养细胞单层的制备
• 1.3.1 猪卵丘细胞（porcine cumulus cell,pCCs）
• 1.3.2 猪卵泡颗粒细胞（porcine follicular granule cwlls,pFGCs）
• 1.3.3 猪输卵管上皮细胞（porcine oviductal epithelial cells,pOECs）
• 1.3.4 猪卵巢皮质细胞（porcine ovarian cortex cells,pOCCs）
• 1.4 猪 COCs 的 IVM
• 1.5 猪卵母细胞的 IVF
• 1.6 受精胚的鉴定与体外培养（In vitro culture,IVC）
• 1.7 谷胱苷肽（GSH）的测定
• 1.8 皮质颗粒细胞（cortical granule cells,CGs）的鉴定
• 1.9 卵母细胞成熟的鉴定
• 2 试验设计
• 2.1 猪卵母细胞 IVM 中激素浓度与处理时间对成熟的影响
• 2.2 IVM 中共培养体系对猪卵母细胞核质同步成熟的影响
• 2.3 IVM 中同源性细胞共培养对卵母细胞受精与胚胎发育的影响
• 2.4 统计分析
• 3 结果
• 3.1 猪卵母细胞 IVM 中激素与处理时间对成熟的影响
• 3.2 IVM 中条件化共培养体系对猪卵母细胞核质同步成熟的影响
• 3.3 IVM 中同源性细胞共培养对卵母细胞受精与胚胎发育的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 第四章 猪卵母细胞体外受精体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与培养基
• 1.2 猪 COCs 的挑选、处理与IVM
• 1.3 共培养细胞单层的制备
• 1.3.1 猪卵泡颗粒细胞（porcine follicular granule cells, pFGCs）
• 1.3.2 猪输卵管上皮细胞（porcine oviductal epithelial cells, pOECs）
• 1.4 猪卵母细胞的 IVF
• 1.5 IVF 后的鉴定
• 2 试验设计
• 2.1 精液的预处理对 IVF 的影响
• 2.2 精子密度对 IVF 与早期胚胎发育的影响
• 2.3 卵丘细胞对 IVF 与早期胚胎发育的影响
• 2.4 IVF 中同源性细胞共培养对 IVF 的影响
• 2.5 统计分析
• 3 结果
• 3.1 精液的预处理对 IVF 的影响
• 3.2 精子密度对 IVF 与早期胚胎发育的影响
• 3.3 卵丘细胞对 IVF 与早期胚胎发育的影响
• 3.4 IVF 中同源性细胞共培养对 IVF 的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 第五章 猪早期胚胎的体外培养
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与培养基
• 1.2 猪 COCs 的挑选、处理与IVM
• 1.3 共培养细胞单层的制备
• 1.3.1 猪卵泡颗粒细胞（porcine follicular granule cells, pFGCs）
• 1.3.2 猪输卵管上皮细胞（porcine oviductal epithelial cells, pOECs）
• 1.4 猪卵母细胞的 IVF
• 1.5 受精胚胎的体外培养（IVC）与检测
• 2 试验设计
• 2.1 EGF、IGF-1 与血清或蛋白对猪早期胚胎发育的影响
• 2.2 同源性细胞单层共培养对早期胚胎发育的影响
• 2.3 统计分析
• 3 结果
• 3.1 EGF、IGF-1 与血清或蛋白对猪早期胚胎发育的影响
• 3.2 同源性细胞单层共培养对猪早期胚胎发育的影响
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介