论文摘要
青光眼是致盲的主要眼病之一，是一组威胁视神经视觉功能，与眼球内压力(IOP)有关的临床征群。眼压超过了眼球内组织所能承受的限度，尤其是视网膜、视神经，将会给眼球内组织带来损害，导致不可逆的视力丧失。因此降眼压是青光眼治疗的主要手段之一。眼压的稳定有赖于房水的生成量与排出量的动态平衡。抑制房水产生或增加房水排出均可降低眼压。碳酸酐酶抑制剂(CAI)治疗青光眼和降眼压的作用机制是抑制眼睫状体上皮细胞的碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)，减少房水的生成，从而起到减低眼压的作用。现在临床上常用的碳酸酐酶抑制剂如醋甲唑胺、乙酰唑胺，水溶性差，不可局部用药，只能口服，为在眼部达到有效的用药浓度，口服剂量较大，因而导致一系列严重副作用。美国FDA批准的局部用碳酸酐酶抑制剂眼药水布林唑胺(派立明)和多佐胺已在临床上应用，但价格昂贵，已报导有眼局部副作用而不能被病人长期耐受。所以研发新型局部用碳酸酐酶抑制剂依然为临床眼药应用的热点。理想的滴眼液应使药物在眼局部均匀分布，并且较长时间滞留。由于眼角膜上皮层的亲脂结构及经常性泪液冲洗，常使眼表面药物的消除半衰期变短，难以达到预期效果。载药纳米微粒是纳米技术与现代医药学结合的产物，是一种新型的药物输送载体。由于其具有小尺寸效应、量子效应、表面和界面效应以及纳米粒的协同效应，使物质的性能发生变化，因此拥有了许多普通药物所不具备的功能，如：使药物经角膜吸收增加，药物作用增强或时效延长，非角膜吸收减少，副作用减轻等。将传统的碳酸酐酶抑制剂醋甲唑胺与纳米载药系统结合，设想制备新型碳酸酐酶抑制剂滴眼液，改变药物的水溶性，延长其与角膜的接触时间，增加降眼压疗效并且减少副作用。本文制备可生物降解的钙纳米药物传递系统，将醋甲唑胺载入，研制成钙纳米醋甲唑胺滴眼液；观察其对家兔的降眼压作用和房水药物动力学变化；并通过急毒、眼刺激等毒理试验评价其临床应用的安全性。研究方法1．钙纳米粒子的制备与表征：采用液相沉淀法，在不同温度、缓冲液、液体混合方式下制备钙纳米粒子，并用扫描电镜(SEM)、粒度分布仪、X射线能谱仪(XPS)等测试手段对钙纳米粒子的结构、大小和形状等进行表征。2．钙纳米醋甲唑胺滴眼液的研制：取醋甲唑胺原料药适量完全溶解于无水乙醇50ml中，加入钙纳米粒子混悬液(40mg／ml)，4℃下在摇床上摇动2h，8500rpm离心三次，每次15min，移去上清，加入双蒸水稀释沉淀，即获得钙纳米醋甲唑胺滴眼液。采用反相高效液相色谱法(HPLC)、pH计等手段测定其浓度、pH值。3．钙纳米醋甲唑胺滴眼液降眼压药效实验：取健康新西兰白兔和青紫蓝兔各20只，分4组，每组5只动物，结膜囊内分别滴入钙纳米醋甲唑胺滴眼液、空白纳米混悬液、1％派立明滴眼液、双蒸水。各组于用药前及用药后1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h测眼压。4．反相高效液相色谱法(HPLC)分析房水药物实验：取24只健康的新西兰白兔，随机分为实验组和对照组，每组12只。实验组每只兔的双眼结膜囊内准确点入钙纳米醋甲唑胺滴眼液100μl，对照组每只兔的双眼同法点入双蒸水100μl，分别在给药后15、30、60、90、120、180min抽取房水0.1ml，反相高效液相色谱法测定房水中药物浓度。5．钙纳米醋甲唑胺滴眼液的毒理学试验：按《新药毒理学研究指导原则》的要求和方法进行钙纳米醋甲唑胺滴眼液家兔眼的单次刺激试验、多次刺激试验、家兔眼的急毒试验、过敏试验、经小鼠腹腔途径的急毒试验。研究结果1．钙纳米粒子的制备、表征及钙纳米醋甲唑胺滴眼液的研制：4℃条件下以柠檬酸钠为缓冲液，从两侧分别同时缓慢滴加等体积的氯化钙和磷酸氢二钠并持续搅拌12h，超声处理30min，得到钙纳米粒子。扫描电镜观察制备的钙纳米粒子为较理想的颗粒状，经粒径分析，30％钙纳米粒子直径≤210nm，90％直径≤440nm，99％直径≤900nm，平均直径为400nm。X射线能谱仪分析，按原子数计算，Ca占21.4％，P占13.57％，O占65.03％。Ca、P、O原子数之比约为3∶2∶8。钙纳米醋甲唑胺滴眼液的药物浓度范围400～500μg／ml，pH 6.8～7.5。2．钙纳米醋甲唑胺滴眼液新西兰白兔降眼压药效实验：1％派立明滴眼液在滴药后1h开始降眼压，持续至6h，其中降眼压峰值为2.73±1.03mmHg；钙纳米醋甲唑胺滴眼液在滴药后1h开始降眼压，持续至8h，并且还有下降趋势，最大降眼压峰值为6.14±0.96mmHg，与1％派立明滴眼液比较有显著统计学意义。3．钙纳米醋甲唑胺滴眼液青紫蓝兔降眼压药效实验：1％派立明滴眼液与钙纳米醋甲唑胺滴眼液在点药后2h为眼压下降峰值，1％派立明滴眼液的降眼压峰值是2.30±1.24mmHg，钙纳米醋甲唑胺滴眼液为4.20±1.38mmHg，两者比较具有显著性差异。4．反相高效液相色谱法(HPLC)分析房水药物浓度：本实验药物峰与杂质峰分离较好，房水中醋甲唑胺浓度在0.05～10μg／ml范围内，线性关系良好。结膜囊给药后15、30、60、90、120、180min房水中醋甲唑胺的浓度分别为0.30、0.060、0.064、0.061、0.063、0.025μg／ml。5．钙纳米醋甲唑胺滴眼液的急性、刺激、过敏等毒理学试验：经全身或局部用药观察，均未发现钙纳米醋甲唑胺滴眼液的毒性和其他副作用。实验结果符合SFDA新药指导原则。结论1．通过均相沉淀法技术，制备了大小、形态较理想的钙纳米粒子。并研制成钙纳米醋甲唑胺滴眼液。2．本研究研制的钙纳米醋甲唑胺滴眼液，具有明显的降眼压作用，其降眼压作用明显强于派立明(布林唑胺)，且作用时间延长。房水药物HPLC分析结果证明了本实验室研制的钙纳米醋甲唑胺滴眼液能有效进入眼内，具有良好的应用前景。3．钙纳米醋甲唑胺滴眼液安全性试验结果表明本文制备的钙纳米醋甲唑胺滴眼液无毒性副作用，用于滴眼是安全的。