结核分枝杆菌中3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶的功能及其调控研究

论文摘要

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）是一种重要的传染性病原菌,能够感染人和多种动物引发结核病。已有研究表明,结核分枝杆菌具有极强的基因突变能力并产生耐药性,从而能够长期在宿主细胞内潜伏。针对目前结核分枝杆菌的基因突变和DNA修复机制不清,本课题初步探索了结核分枝杆菌的DNA修复蛋白3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶（Rv1688）的功能及调控机制,主要获得了如下结果：（1）通过细菌双杂交筛选鉴定了一批与Rv1688相互作用的基因,其中包括一个TetR类型的转录因子Rv0825c；（2）发现了Rv0825c能够刺激Rv1688切割受损DNA活性,初步证实了这种刺激作用是通过增强Rv1688的损伤DNA结合活性；（3）证实了这两个蛋白之间的相互作用在耻垢分枝杆菌中也是保守的。（4）证实了Rv0825c能够与Rv1688的启动子序列相互作用,因此Rv0825c可能也对Rv1688基因的表达有转录调控影响。分枝杆菌中的DNA转葡糖基酶的功能及其调控很少被研究,由于这一类基因在DNA切除修复中可能发挥关键作用,因此对于病原菌的基因突变和耐药性的产生有直接影响。本研究对结核分枝杆菌的此类酶的功能及其调控机制的研究将增强我们对结核耐药问题的理解,相关工作有待进一步深入。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 前言
• 1 结核病与结核分枝杆菌
• 2 碱基切除修复与3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶
• 2.1 DNA损伤与碱基切除修复
• 2.2 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶（MAG或AAG）
• 2.3 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶的底物
• 2.4 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶对受损底物的识别
• 2.5 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶与DNA结合的复合结构
• 2.6 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶的调控
• 3 结核分枝杆菌的Rv0825c是一个TetR类型的转录因子
• 4 课题研究的目的意义与目标
• 5 课题研究主要内容
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 酶、试剂和试剂盒
• 1.3 供试抗生素
• 1.4 引物
• 1.5 供试质粒
• 1.6 其余缓冲液、试剂
• 1.7 培养基
• 2 方法与步骤
• 2.1 分子生物学基本操作
• 2.2 细菌双杂交实验
• 2.3 细菌单杂交实验
• 2.4 融合蛋白的亲和纯化
• 2.5 DNA底物的同位素标记
• 2.6 3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶切割实验
• 2.7 凝胶阻滞迁移分析（EMSA）
• 2.8 Western blotting检测
• 第三章 结果与分析
• 1 鉴定与3-甲基腺嘌呤DNA转葡糖基酶相互作用的基因
• 2 两个分枝杆菌同源基因的序列比对
• 3 相关基因的克降表达
• 3.1 相关基因以及突变基因的克隆
• 3.2 相关基因以及突变体的表达
• 4 结核分枝杆菌中Rv1688与Rv0825c相互作用
• 4.1 细菌双杂交验证相互作用
• 4.2 Rv0825c刺激Rv1688切割受损DNA活性
• 4.3 Rv0825c刺激Rv1688结合受损DNA活性
• 5 耻垢分枝杆菌中两同源基因之间的相互作用
• 5.1 双杂交验证分析
• 5.2 随机突变筛选失去相互作用的突变体
• 5768抗体的制备与检测'>5.3 MSMEG₅768抗体的制备与检测
• 6 Rv0825c与Rv1688启动子相互作用
• 6.1 Rv0825c与Rv1688启动子单杂交
• 6.2 Rv0825c与Rv1688启动子EMSA实验
• 第四章 总结与讨论
• 1 总结
• 2 讨论
• 2.1 结核分枝杆菌中Rv1688
• 2.2 Rv1688与Rv0825c相互作用
• 参考文献
• 致谢