东亚三角涡虫cDNA文库的构建及DjGon基因的进化、表达分析

论文摘要

东亚三角涡虫（Dujesia japonica）是扁形动物门的代表动物。在动物演化的历史进程中,扁形动物是首次出现两侧对称、三胚层的类群。其所处的特殊演化地位,和强大的再生作用,为我们研究动物起源、进化、胚胎发育、染色体、行为以及细胞分化与脱分化分子机理提供了优良材料。本文应用Clontech公司CreatorTMSMARTTM cDNA Library Construction Kit,构建了东亚三角涡虫cDNA文库。对文库克隆进行序列测定和生物信息学分析,共获得208个rRNA基因,148个编码蛋白基因,78个位于染色体上片段基因。编码蛋白大体分为:38个和酶类有关蛋白,27个参与基因调节与信号传导蛋白,11个位于线粒体细胞器中的蛋白,18个维持细胞结构,负责细胞内物质转运的蛋白,7个与肿瘤相关蛋白,5个泛素蛋白家族成员。这些基因在涡虫中多数均为首次报道,并且许多具有完整的开放性阅读框（ORF）,甚至有些极有可能是涡虫中的特有基因,对这些基因的深入研究,可能为将来揭示涡虫再生作用过程的分子机制和发育进化中的特殊地位提供物质基础。从东亚三角涡虫文库中分离的克隆K30,经生物信息学分析表明和人、老鼠、马、牛等哺乳动物同源性高于28%,该蛋白具有ADAMTS家族某些成员的GON保守结构域。利用该基因编码的296个氨基酸残基组成的蛋白进行进化分析,表明东亚三角涡虫DjGon基因可能代表了脊椎动物ADAMTS-9和-20基因分化前的一种前体基因型。通过Southern blot和整体原位杂交等技术,研究了东亚三角涡虫DjGon基因的表达图式。Southern blot表明该基因在涡虫体内为两拷贝;整体原位杂交表明该基因在幼虫发育不同时期不同组织的表达存在差异:肠中信号较强,而皮肌囊较弱,且皮肌囊内的信号由头向尾梯度减弱。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.涡虫
• 1.1 分类学研究
• 1.2 生活习性
• 1.3 繁殖方式
• 1.4 形态结构
• 2.涡虫分子生物学研究及其发育和进化
• 2.1 涡虫的再生作用
• 2.2 涡虫的干细胞
• 2.3 涡虫的发育生物学
• 3.ADAMTS基因研究进展
• 3.1 ADAMTS的发现
• 3.2 ADAMTS的结构特征
• 3.3 ADAMTS的生物功能
• 3.4 ADAMTS的表达调控
• 3.5 ADAMTS研究展望
• 4 本文研究的目的及意义
• 5 本文主要内容及技术路线
• 5.1 主要研究内容
• 5.2 技术路线
• 第二章 东亚三角涡虫cDNA文库的构建及初步分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3.结果
• 3.1 东亚三角涡虫总RNA的提取
• 3.2 东亚三角涡虫cDNA的合成
• 3.3 东亚三角涡虫cDNA文库的构建和鉴定
• 3.4 东亚三角涡虫cDNA的序列分析
• 4.讨论
• 第三章 东亚三角涡虫DjGon基因的生物信息学分析
• 1.前言
• 2.方法
• 3.结果
• 3.1 东亚三角涡虫DjGon基因的序列分析
• 3.2 东亚三角涡虫DjGon基因的序列比较
• 3.3 东亚三角涡虫DjGon基因的进化分析
• 4.讨论
• 第四章 东亚三角涡虫DjGon基因的克隆及表达分析
• 1.前言
• 2 材料和方法
• 2.1 东亚三角涡虫的固定
• 2.2 材料
• 2.3 DjGon与pcDNA3载体的连接
• 2.4 Dot blot
• 2.5 Northern blot
• 2.6 Southern blot
• 2.7 整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization）
• 3 结果
• 3.1 DjGon基因与pcDNA3载体的连接
• 3.2 东亚三角涡虫基因组DNA的提取
• 3.3 RNA探针的合成
• 3.4 Dot blot
• 3.5 Northern blot
• 3.6 Southern blot
• 3.7 Whole mount in situ hybridizalion
• 4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢