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在大肠杆菌内引入MVA途径高效合成抗疟药青蒿素前体—紫穗槐-4，11-二烯

2020-12-16阅读(418)

在大肠杆菌内引入MVA途径高效合成抗疟药青蒿素前体—紫穗槐-4，11-二烯

论文摘要

以青蒿素为基础的联合药物疗法（ACTs）被认为是目前治疗恶性疟疾的最有效方法。然而青蒿素供应不足且价格昂贵,限制了ACTs的广泛使用。本研究旨在采用基因工程手段构建异源类异戊二烯生物合成途径,利用大肠杆菌发酵高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯。首先在Escherichia coli DHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因,利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸（FPP）,成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给,引入粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的甲羟戊酸（MVA）途径,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了13.3倍,达到151 mg/L。进一步研究发现了3个限速酶,分别是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA还原酶和甲羟戊酸激酶；通过调节这些酶的水平,紫穗槐-4,11-二烯产量提高了7.2倍,摇瓶培养达到235 mg/L,为高效生物合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯奠定了基础。另外,本研究建立了薄层色谱法（TLC）快速半定量检测甲羟戊酸含量,并建立了气相色谱与质谱联用法（GC-MS）定量检测甲羟戊酸和紫穗槐-4,11-二烯含量,为代谢产物含量测定和代谢途径调控提供了技术支持。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 中文文摘
  • 目录
  • 绪论
  • 第一章 在大肠杆菌内引入ADS产紫穗槐-4,11-二烯
  • 1.1 前言
  • 1.2 实验材料与方法
  • 1.2.1 实验材料
  • 1.2.1.1 菌株
  • 1.2.1.2 培养基
  • 1.2.1.3 工具酶
  • 1.2.1.4 标准品
  • 1.2.1.5 试剂盒
  • 1.2.1.6 化学试剂
  • 1.2.1.7 相关溶液
  • 1.2.1.8 主要仪器设备
  • 1.2.2 实验方法
  • 1.2.2.1 全基因合成ADS
  • 1.2.2.2 质粒pET28-ADS的构建
  • 1.2.2.3 化学感受态细胞的制备与化学转化
  • 1.2.2.4 目的基因的表达
  • 1.2.2.5 紫穗槐-4,11-二烯生产菌的摇瓶培养
  • 1.2.2.6 紫穗槐-4,11-二烯的检测方法
  • 1.3 实验结果与分析
  • 1.3.1 质粒pET28-ADS的构建
  • 1.3.1.1 质粒pET28-ADS图谱
  • 1.3.1.2 转化子pET28-ADS/DH5α的菌落PCR鉴定
  • 1.3.1.3 质粒pET28-ADS的酶切鉴定
  • 1.3.1.4 质粒pET28-ADS的基因测序鉴定
  • 1.3.2 表达ADS产紫穗槐-4,11-二烯
  • 1.3.2.1 诱导表达ADS
  • 1.3.2.2 菌株pET28-ADS/DHGT7产紫穗槐-4,11-二烯
  • 1.4 本章小结
  • 第二章 引入MVA途径提高紫穗槐-4,11-二烯产量
  • 2.1 前言
  • 2.2 实验材料与方法
  • 2.2.1 实验材料
  • 2.2.2 实验方法
  • 2.2.2.1 E.faecalis基因组的提取
  • 2.2.2.2 目的基因的获得
  • 2.2.2.3 质粒pET3-ES的构建
  • 2.2.2.4 质粒pET3FL-MD的构建
  • 2.2.2.5 质粒pAOC3-ES-MD的构建
  • 2.2.2.6 质粒pET28-ispA-ADS的构建
  • 2.2.2.7 甲羟戊酸生产菌的摇瓶培养
  • 2.2.2.8 甲羟戊酸的检测方法
  • 2.3 实验结果与分析
  • 2.3.1 质粒pET3-ES的构建
  • 2.3.1.1 质粒pET3-E、pET22-S和pET3-ES图谱
  • 2.3.1.2 转化子的菌落PCR鉴定
  • 2.3.1.3 质粒pET3-E和pET22-S的鉴定
  • 2.3.1.4 质粒pET3-ES的酶切鉴定
  • 2.3.2 表达ES产甲羟戊酸
  • 2.3.2.1 诱导表达mvaE和mvaS
  • 2.3.2.2 菌株pET3-ES/DHGT7产甲羟戊酸
  • 2.3.3 质粒pET3FL-MD的构建
  • 2.3.3.1 质粒pET3FL和pET3-MD图谱
  • 2.3.3.2 质粒pET3L和pET3FL的基因测序鉴定
  • 2.3.3.3 转化子pET3FL-MD/HST04的菌落PCR鉴定
  • 2.3.3.4 质粒pET3FL-MD的酶切鉴定
  • 2.3.3.5 质粒pET3FL-MD的基因测序鉴定
  • 2.3.4 质粒pAOC3-ES-MD的构建
  • 2.3.4.1 质粒pAOC3ANL、pAOC3-ES和pAOC3-ES-MD图谱
  • 2.3.4.2 质粒pAOC3ANL的基因测序鉴定
  • 2.3.4.3 转化子的菌落PCR鉴定
  • 2.3.4.4 质粒pAOC3-ES和pAOC3-ES-MD的酶切鉴定
  • 2.3.5 质粒pET28-ispA-ADS的构建
  • 2.3.5.1 质粒pET28-ispA-ADS等图谱
  • 2.3.5.2 质粒pET3AL的基因测序鉴定
  • 2.3.5.3 转化子的菌落PCR鉴定
  • 2.3.5.4 质粒pET3AL-ispA的鉴定
  • 2.3.5.5 质粒pET3AL-ispA-ADS和pET28-ispA-ADS的酶切鉴定
  • 2.3.6 贯通整个异源紫穗槐-4,11-二烯合成途径
  • 2.4 本章小结
  • 第三章 优化异源紫穗槐-4,11-二烯合成途径
  • 3.1 前言
  • 3.2 实验材料与方法
  • 3.2.1 实验材料
  • 3.2.2 实验方法
  • 3.2.2.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的构建
  • 3.2.2.2 质粒pET28-E-ADS的构建
  • 3.2.2.3 质粒pET28-E-MK-ADS的构建
  • 3.3 实验结果与分析
  • 3.3.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的构建
  • 3.3.1.1 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS图谱
  • 3.3.1.2 转化子pAOC3-ES-MD-ispA-ADS/DHG5α菌落PCR鉴定
  • 3.3.1.3 质粒pAOC3-ES-MD-ispA-ADS的酶切鉴定
  • 3.3.2 质粒pET28-E-ADS的构建
  • 3.3.2.1 质粒pET3-E-ADS和pET28-E-ADS图谱
  • 3.3.2.2 转化子的菌落PCR鉴定
  • 3.3.2.3 质粒pET3-E-ADS和pET28-E-ADS的酶切鉴定
  • 3.3.3 质粒pET28-E-MK-ADS的构建
  • 3.3.3.1 质粒pET3FL-MK和pET28-E-MK-ADS图谱
  • 3.3.3.2 转化子的菌落PCR鉴定
  • 3.3.3.3 质粒pET3FL-MK的鉴定
  • 3.3.3.4 质粒pET28-E-MK-ADS的酶切鉴定
  • 3.3.4 优化紫穗槐-4,11-二烯合成途径
  • 3.3.5 不同宿主产紫穗槐-4,11-二烯
  • 3.4 本章小结
  • 第四章 结论
  • 附录1
  • 附录2
  • 附录3
  • 参考文献
  • 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

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