新城疫病毒F基因乳酸菌表达载体的构建与表达

论文摘要

新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastl disease virus,NDV）所致的一种高度接触性的传染病,能引起鸡、火鸡、鸭、鸽子和鹦鹉等多种禽类的感染和死亡,给世界养禽业造成巨大损失,因此国际兽疫局将其定为Ⅰ类传染病。目前,对该病的防制仍以疫苗免疫为主。但传统的疫苗存在着价格昂贵,操作繁琐,免疫保护期不长,免疫不全以及毒力返强等问题。随着分子生物学研究的不断深入,现已明确F蛋白是NDV的主要保护性抗原之一,在疫苗的研制中具有重要的意义。本实验选择乳酸菌作为受体菌株表达外源基因F,即可将乳酸菌的益生功能和外源基因的特异性免疫相结合,从而研制新城疫病毒F基因工程乳酸菌。目的在于为开发研制预防新城疫毒病的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基础。在本研究中,用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,从NDV的总RNA中扩增了1662bp的F基因。通过T4 DNA连接酶将其直接连接于克隆质粒载体pMD-18-T中,转化至受体菌JM109中,通过质粒提取、酶切鉴定、PCR鉴定、序列测定,证明重组质粒pMD-18-T-F中含有NDV F基因。经氨基酸序列分析,表明克隆了NDV的主要保护性抗原F全基因的抗原表位区。然后,将NDV主要保护性抗原F克隆至可在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的具有红霉素和胸苷酸基因的双标记表达载体。经过优化电转化条件,将重组质粒pW425et-F转化到乳酸菌受体菌中,通过乳酸菌质粒的提取,酶切分析和PCR方法鉴定阳性克隆质粒。将筛选好的阳性克隆进行SDS-PAGE及Western bloting检测,结果表明外源基因F在乳酸菌中获得了表达。结果表明,成功构建了NDV F基因食品级乳酸菌表达载体并使其在乳酸菌中获得了表达,从而为进一步研究NDV基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 前言
• 1 关于乳酸菌的概述
• 2 新城疫病毒综述
• 3 研究的目的及意义
• 第二部分 实验内容
• 实验一 新城疫病毒F基因的克隆与序列分析
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二 新城疫乳酸菌表达载体PW425ET-F的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三 重组质粒PW425ET-F在乳酸菌中的表达
• 1 材料与试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 中英文缩略语
• 测序报告
• 致谢
• 作者简介