茶树种子低温贮藏过程中热激蛋白的差异表达与分析

论文摘要

茶树是我国重要的经济作物之一,在国民经济中占有重要的地位。我国是茶树的起源地,种质资源极其丰富,在茶树分类系统的37个种和3个变种中,除毛肋茶外,其余全产在中国。目前在茶树种质资源的保存问题上,因种子贮藏特性偏向于顽拗型种子,既不耐低温又不耐干燥,而不得不采用种植保存。这种保存方式不仅占用大量的土地和人力资源,还极易受外界环境影响。离体培养技术由于需要长期继代培养不仅费钱费力,而且会引起遗传不稳定性。更为麻烦的是茶树是多年生木本植物,多酚类含量很高,目前的技术和水平远远不能达到中、长期保存种质资源的要求。茶树种子是茶树本身自然繁殖的后代,贮藏着完整的遗传信息,作为保存材料携带、运输和贮藏都非常方便,对繁衍和传播具有重要作用,长期保存种子是解决品种退化的关键,因此研究茶树种子贮藏的意义显得尤为重要。传统贮藏种子的方法是沙藏法,即保存在一定湿度、温度和通气条件的环境中,但随着贮藏时间的延长,发芽率迅速下降,半年后只有20%左右。长期以来对这方面的研究较少,少数几篇研究对保存方法进行了初步有益的尝试。但是迄今少有对种子在保存过程中生理、生化和细胞学等领域进行研究,更少涉及到分子生物学机理。cDNA-AFLP技术是近年来发展起来的一种重要的转录基因组学研究工具,因其可靠性高、重复性好、且不需要预先知道序列信息、所需仪器设备简单,被广泛应用于基因差异表达的研究。本研究针对茶树种子不耐低温贮藏的情况,以茶树中的高结实率品种龙井43为研究对象,通过cDNA-AFLP方法研究同一茶树品种种子低温贮藏前后的基因表达谱的差异表现特征,并结合RT-PCR对差异表达的基因进行鉴定,以生物信息学手段对差异表达基因进行结构分析和功能预测。并对与低温诱导有关的未知功能基因的序列,用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆其全长cDNA序列并进行序列分析。希望能够揭示茶树种子对低温诱导的相关分子机制,通过研究取得了如下结果:（1）对低温处理茶籽和新鲜对照茶籽进行8对引物组合的差异显示分析,发现低温处理样和新鲜对照样的茶籽之间存在表达差异。在所鉴定的10个差异片段中,有2个片段序列没有发现同源序列;有1个片段序列与未知功能蛋白相关;其余7个差异表达的片段序列分别与小分子量热激蛋白、MYB类转录因子、衰老相关蛋白、F-box家族蛋白、蛋白激酶、磷酸二酯酶1,4-α-葡聚糖-麦芽水解酶等基因有同源性。（2）利用RACE技术得到了TDF3 cDNA全长,全长为819bp。经BLAST查询比对,该基因序列与小分子量热激蛋白有很高的同源性。TDF3的ORF为453bp,编码150个氨基酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 植物种质资源保存研究进展
• 1.1.1 种子的分类
• 1.1.2 顽拗型植物种质资源的保存现状
• 1.1.3 茶树种质资源的保存现状
• 1.2 cDNA-AFLP技术及其在基因差异表达分析中的应用
• 1.2.1 cDNA-AFLP技术的原理和实验流程
• 1.2.2 cDNA-AFLP技术的关键
• 1.2.3 cDNA-AFLP技术的特点
• 1.2.4 cDNA-AFLP技术在分离特异表达基因中的应用
• 1.3 植物热激蛋白的研究现状
• 1.3.1 热激蛋白的分类
• 1.3.2 热激蛋白的功能
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 本研究的技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 化学试剂与仪器
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 成熟种子总含水量及临界含水量的测定
• 3.3.2 低温贮藏茶树种子总RNA的提取与检测
• 3.3.3 双链cDNA的合成
• 3.3.4 cDNA-AFLP差异分析
• 3.3.5 差异条带的回收、克隆、测序
• 3.3.6 差异片段TDF3的RT-PCR检测
• 3.3.7 差异片段TDF3全长cDNA的克隆
• 4 结果与分析
• 4.1 成熟种子总含水量及临界含水量的测定结果
• 4.2 茶树种子在低温贮藏过程中的cDNA-AFLP分析
• 4.2.1 总RNA的提取与检测
• 4.2.2 双链cDNA的合成
• 4.2.3 cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系的优化
• 4.2.4 cDNA-AFLP聚丙烯酰胺变性胶电泳结果
• 4.2.5 差异片段的二次扩增以及克隆、测序
• 4.2.6 特异片段片段的测序结果与序列同源性分析
• 4.3 TDF3片段的RT-PCR检测及序列分析
• 4.4 TDF3片段全长cDNA的克隆
• 4.4.1 TDF3片段的3'RACE扩增
• 4.4.2 TDF3片段的5'RACE扩增
• 4.4.3 TDF3片段cDNA全长序列的拼接及分析
• 4.4.4 TDF3的ORF及其氨基酸序列的预测
• 4.4.5 TDF3片段cDNA全长序列的扩增
• 5 讨论
• 5.1 茶树种子低温贮藏后的基因表达差异分析
• 5.2 TDF3全长cDNA的克隆
• 6结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A文中英文缩写与注释
• 作者简介
• 成果清单