论文摘要
碳纳米管（CNT）是一种具有独特结构、化学组成和物理性质的新型纳米材料,其独特的物理化学性质吸引了众多学者的研究兴趣,其中以生物医学应用为目标的探索性研究正在迅速形成一个新的研究领域。多壁碳纳米管（MWNT）是碳纳米管的一种,其应用于医学领域必须具备很多特性,包括生物相容性、无毒、不致癌、不致畸、不致突变和非抗原性。通过引入功能化基团,碳纳米管的水溶性和生物相容性得到改善,从而为其在生物医学领域的应用奠定了基础。巨噬细胞是免疫系统中的重要细胞,在免疫反应的多个阶段发挥作用,其主要功能是清除异物、调节免疫反应和炎症反应。功能化多壁碳纳米管（f-MWNTs）进入机体后,是否会对巨噬细胞产生毒性并影响其生物学功能目前尚不清楚。我们率先开展该领域的研究,并取得了一些初步的成果。目的:1、探讨商品化多壁碳纳米管（p-MWNT）经过羧基化、酰化、酯化简单修饰后得到的三种功能化碳纳米管,对原代巨噬细胞——小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响。2、研究多壁碳纳米管经不同修饰后引发PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞毒性、细胞功能影响与其功能化修饰之间的关系,并初步探讨功能化多壁碳纳米管引发THP-1单核巨噬细胞毒性的机理。方法:1.功能化多壁碳纳米管对原代小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响1.1 p-MWNT经过羧基化、酰化、酯化修饰,得到简单修饰的三种功能化多壁碳纳米管MWNT-COOH,MWNT-Tyr和MWNT-iBA。产物通过傅立叶红外,元素分析表征其表面修饰上功能化基团1.2由小鼠腹腔获得原代巨噬细胞。1.3将p-MWNT及f-MWNTs（MWNT-COOH,MWNT-Tyr和MWNT-iBA）与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育6～48小时,显微镜下观察摄入情况,并检测细胞增殖及NO生成情况。2.功能化多壁碳纳米管对PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞的毒性及其对细胞功能的影响2.1基于组合化学方法液相合成含有83种f-MWNTs的多壁碳纳米管库,产物用傅立叶红外,元素分析及高效液相色谱表征其功能化基团。2.2 f-MWNTs以不同浓度作用于PMA诱导的THP-1细胞,通过检测细胞增殖及NO生成情况,初步筛选了p-MWNT和83种f-MWNTs对PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞的毒性。2.3根据1.2的初步筛选结果,挑选出四种不同毒性的f-MWNTs,进一步研究其对PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞的影响。将选出的四种f-MWNTs以不同浓度梯度与PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞共孵育,检测细胞增殖以及NO、肿瘤坏死因子TNF-α和细胞内活性氧的产生情况。结果:1.功能化多壁碳纳米管对小鼠腹腔巨噬细胞的毒性影响1.1成功得到功能化多壁碳纳米管MWNT-COOH,MWNT-Tyr和MWNT-iBA。1.2显微镜下观察由小鼠腹腔获得的原代巨噬细胞具有典型巨噬细胞形态。1.3将p-MWNT及f-MWNTs（MWNT-COOH,MWNT-Tyr和MWNT-iBA）与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育6～48小时:1)24小时后即可在显微镜下观察到f-MWNTs被巨噬细胞摄入至细胞质的现象。2)四种碳纳米管在较高作用剂量400μg/mL时明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的存活率及其对异物的免疫应激能力;其中MWNT-iBA所引起的细胞毒性最小。3)对MWNT-COOH和p-MWNT的深入研究发现,二者对巨噬细胞存活的抑制率具有剂量依赖性,对NO生成具有剂量依赖性和明显时间依赖性。小剂量（＜100ug/mL）的p-MWNT、MWNT-COOH与小鼠腹腔巨噬细胞共孵育48小时并不损伤其免疫应激能力（NO产生）,但巨噬细胞对MWNT-COOH的免疫应激明显弱于p-MWNT。2.功能化多壁碳纳米管对PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞的毒性及其对细胞功能的影响2.1成功获得了含有83种不同基团修饰的多壁碳纳米管库。2.2 83种f-MWNTs作用于PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞,当作用剂量由50μg/mL增加到200μg/mL时,细胞存活率由60%左右降至30%左右;其诱导NO的生成不仅具有剂量依赖性,也与其功能化基团有关。2.3 f-MWNTs 2#、43#、49#和67#作用于PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞,细胞毒性与细胞功能影响不仅呈现剂量依赖性,各材料之间所引起细胞效应也明显不同。在作用剂量10μg/mL时,四种碳纳米管均未引起免疫细胞毒性。随着作用剂量的增大,2#碳纳米管（MWNT-COOH）引起明显的细胞存活抑制,400μg/mL时降至40%以下;NO、TNF-α、活性氧的生成也显著增加。49#和67#碳纳米管虽然对PMA诱导的THP-1细胞的存活率有抑制（在400μg/mL的作用剂量下为55.31%和51.90%）,但是其引起的NO、活性氧和TNF-α的生成较2#显著减少。在结果中还发现,43#碳纳米管对细胞的影响略强于49#和67#碳纳米管。结论:1.由组合化学方法得到的功能化多壁碳纳米管,其表面修饰基团具有高度多样性。2.p-MWNTs仅经过简单羧基化修饰后,增加了材料的水溶性的同时也加剧了其引起的免疫应激。经过进一步的氨基酸和酰胺基团修饰后,其生物相容性大大改善。f-MWNTs作用于PMA诱导的THP-1单核巨噬细胞,引起免疫反应的差别主要由功能化修饰基团的不同造成。经过分析,以AC005为修饰基团的一组f-MWNTs所引起的免疫反应普遍较小;而其他修饰基团仅有个别材料表现出较好的生物相容性。进一步研究发现49#、67#碳纳米管对巨噬细胞的影响最小。3.对于原代巨噬细胞来说,f-MWNTs引发的免疫反应与修饰基团有关,其影响有弱到强依次为MWNT-iBA,MWNT-Tyr,MWNT-COOH,和p-MWNT。4.f-MWNTs作为外源异物作用于巨噬细胞,引发NO、TNF-α、活性氧的大量生成,这可能与NF-κB信号通路的活化有关。意义:本研究首次探讨了基于组合化学方法合成的功能化多壁碳纳米管对巨噬细胞的毒性及其细胞功能的影响,分析其中的构效关系,并初步探讨了功能化多壁碳纳米管引起巨噬细胞免疫毒性的机制。对于功能化多壁碳纳米管进行包括免疫学毒性的系统评价,对深入全面了解功能化碳纳米管毒性的作用机制、科学评价其危害后果具有重要意义,也将为其在生物医学领域的应用奠定基础。