刺参Apostichopus japonicus (Selenka)夏眠分子机理的基础研究

论文摘要

刺参属温带种类,当海水温度升高到一定范围后,活动降低、摄食停止,进入夏眠。夏眠期间,刺参机体出现器官退化、代谢减退、防御系统调整等一系列生理生化反应。本论文从分子生物学角度出发,研究了刺参夏眠期间器官退化、基因表达调控、表观遗传调控、抗氧化防御酶类基因调控、离子泵蛋白基因调控等过程,初步探讨刺参夏眠期间各项调控的分子机理。主要研究结果如下:1.刺参夏眠期间消化道组织细胞凋亡是其退化的重要原因。采用室内诱导夏眠实验手段,对夏眠过程中退化显著的消化道进行细胞凋亡研究,发现:25°C温度诱导刺参进入夏眠,消化道组织发生萎缩退化;HE切片观察及TUNEL原位检测细胞凋亡实验直观展示了刺参消化道组织退化中的细胞凋亡过程,表明夏眠刺参消化道退化与细胞凋亡相关;凋亡诱导相关因子基因（BAX、CTSD和ACIN1）表达量检测显示:在实验0天时,BAX表达量显著上调,在实验第5、10天时BAX、CTSD和ACIN1表达均显著上调,在实验20、40天时,各基因表达量均明显回落,表明各因子参与凋亡调控。2.夏眠期间刺参基因表达调控明显,参与各项生命活动的非看家基因表达受到广泛抑制。采用Roche 454（GS FLX Titanium System）cDNA高通量测序技术构建了刺参混合组织夏眠转录表达谱数据库,经分析判定质量较高、数据可靠;利用序列去冗、拼接、注释等生物信息学处理方法,共获得279,933条高质量EST数据,拼接获得87,059条Unigene序列（56,416 Contig和30,643 Singlet）,其中7,786条Unigene获得注释信息,3,755条Unigene获得GO功能注释;对获得的基因序列库进行GO聚类分析,认为具有结合功能（binding）及催化活性（catalytic activity）的基因、参与生物学调节功能（biological regulation）的基因及细胞外组分（extracellular region）合成的基因在刺参夏眠期间受到表达抑制;对数据库序列进行SSR及SNP位点搜索,获得大量多态性位点。3.夏眠期间刺参表观遗传调控明显,与基因表达抑制调控相关。以454高通量测序构建的转录谱数据为基础,筛选8个表观遗传调控相关修饰因子基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程消化道组织DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化调控相关基因表达调控过程。结果显示:刺参夏眠期间,消化道组织DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化调控因子基因表达上调。4.夏眠期间刺参呼吸树抗氧化防御酶类基因表达调控明显。根据基因功能注释,筛选5个抗氧化防御酶类基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程呼吸树组织抗氧化防御酶类基因表达调控过程。研究结果显示:现场调查夏眠刺参呼吸树样品中Cu/Zn-SOD及PRDX5基因表达上调,PRDX6基因表达量基本没有变化,而CAT及PHGPx基因表达量均出现显著下降;室内诱导刺参夏眠过程中,各抗氧化防御酶类均出现基因表达量波动,而在25℃温度条件下40天后各基因表达变化与现场调查实验结果一致。5.夏眠期间刺参消化道离子泵蛋白基因表达较稳定。根据基因功能注释,筛选4个离子泵蛋白基因,结合现场调查及室内诱导夏眠实验,检测刺参夏眠过程消化道离子泵蛋白基因表达调控过程。现场调查实验结果显示,夏眠刺参消化道组织中,V-ATPase, A基因表达量出现显著下调,其他离子泵蛋白基因（Na+/K+ ATPase、SERCA和V-ATPase, B）表达量均保持稳定;室内诱导实验结果与现场调查实验结果一致。

论文目录

• 前言
• 摘要
• Abstract
• 第一章 动物夏眠习性及其机理研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 动物休眠机理研究现状
• 1.2.1 动物休眠分子机理的研究进展
• 1.2.2 休眠动物代谢调控基础理论
• 1.2.3 休眠动物防御系统调整研究
• 1.2.4 休眠动物基因表达抑制调控基础理论
• 1.3 刺参夏眠基础理论及机理研究进展
• 1.3.1 刺参夏眠的基本特征
• 1.3.2 刺参夏眠的影响因素
• 1.3.3 刺参夏眠的调控机理最新进展
• 1.3.4 未来研究趋势
• 1.4 本论文研究目的、意义与思路
• 1.4.1 研究目的及意义
• 1.4.2 研究思路
• 1.4.3 预期成果
• 1.4.4 可能的创新点
• 1.5 本章小结
• 第二章 刺参夏眠期间消化道退化与细胞凋亡的基本特征
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物采捕及暂养
• 2.2.2 升温诱导夏眠
• 2.2.3 样品采集及记录
• 2.2.4 切片制作与细胞凋亡检测
• 2.2.5 基因筛选与引物设计
• 2.2.6 Real-time PCR 基因表达定量及分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 夏眠刺参湿重及消化道重量等指标变化
• 2.3.2 夏眠刺参消化道组织学特征
• 2.3.3 刺参消化道组织细胞凋亡TUNEL 检测结果
• 2.3.4 刺参消化道组织凋亡调控相关基因表达定量检测结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 夏眠刺参消化道细胞凋亡组织形态及组织化学特征
• 2.4.2 夏眠刺参消化道细胞凋亡相关基因表达特征
• 2.5 本章小结
• 第三章 刺参夏眠转录谱数据库构建及初步分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 样品采集
• 3.2.2 总RNA 提取、m RNA 纯化，及其质量鉴定
• 3.2.3 cDNA 合成、酶切、分级分离及纯化
• 3.2.4 454 高通量测序
• 3.2.5 数据分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 总RNA、mRNA、cDNA 浓度及质量鉴定
• 3.3.2 454 测序结果及拼接、注释统计
• 3.3.3 Unigene 数据功能注释、聚类分析及丰度分析
• 3.3.4 SSR 及SNP 位点统计
• 3.4 讨论
• 3.4.1 转录谱数据库质量分析
• 3.4.2 刺参夏眠期间基因表达调控分析
• 3.5 本章小结
• 第四章 刺参夏眠期间表观遗传调控
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验样品采集
• 4.2.2 RNA 提取及cDNA 模板合成
• 4.2.3 表观遗传调控相关基因筛选、生物信息学分析及引物设计
• 4.2.4 Real-time PCR 基因表达定量及分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 DNA 甲基化及染色质重塑调控基因表达
• 4.3.2 组蛋白乙酰化相关基因表达
• 4.3.3 组蛋白甲基化相关基因表达
• 4.4 讨论
• 4.4.1 夏眠刺参消化道组织DNA 甲基化及染色质重塑调控特征
• 4.4.2 夏眠刺参对消化道组织组蛋白乙酰化调控特征
• 4.4.3 夏眠刺参消化道组织组蛋白甲基化调控特征
• 4.5 本章小结
• 第五章 刺参抗氧化防御基因筛选及夏眠期间表达变化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验动物样品采集
• 5.2.2 RNA 提取及cDNA 模板合成
• 5.2.3 抗氧化防御相关基因筛选、功能分析及引物设计
• 5.2.4 Real-time PCR 基因表达定量及分析
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 抗氧化防御相关基因生物信息学分析
• 5.3.2 抗氧化防御相关基因表达
• 5.3.3 夏眠刺参呼吸树组织抗氧化防御相关基因表达特征
• 5.4 本章小结
• 第六章 刺参离子泵蛋白基因筛选及夏眠期间表达变化
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验动物样品采集
• 6.2.2 RNA 提取及cDNA 模板合成
• 6.2.3 离子通道蛋白基因筛选、功能分析及引物设计
• 6.2.4 Real-time PCR 基因表达定量及分析
• 6.3 实验结果与讨论
• 6.3.1 通道蛋白基因生物信息学分析
• 6.3.2 离子泵蛋白基因表达
• 6.3.3 夏眠刺参消化道组织离子泵蛋白基因表达特征
• 6.4 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 研究总结
• 7.2 存在问题
• 7.3 研究展望
• 参考文献
• 博士期间文章撰写与发表情况
• 致谢