硫化氢缓解缺血再灌注肾损伤机制研究

论文摘要

急性肾衰竭（acute renal failure, ARF）是由各种病因引起,肾功能在短期内（数小时至数天）迅速减退,肾小球滤过功能显著下降,血尿素氮及肌酐迅速升高,并引起机体水、电解质和酸碱平衡失调,以及急性尿毒症等的临床综合症状。肾缺血再灌注导致的肾脏损伤（renal ischemia reperfusion injury, RIRI）是导致缺血性ARF的主要原因,在器官移植中更是难以避免。RIRI发生机制复杂,涉及自由基的作用、细胞钙超载、能量代谢障碍等,有资料显示炎性介质、粘附分子、多种细胞因子参与RIRI,但至今其发病机制尚未完全阐明。急性肾衰竭中肾脏损伤若不能及时修复,可导致病变持续数周甚至多年,转变成不可逆的慢性进行性肾功能不全。2010年12月,Kidney International杂志连续刊登5篇review,均把肾移植后肾功能变化的关注焦点集中在远期效应上从对肾移植后的远期保护性干预、感染与慢性移植肾损伤、病理学改变等方面探讨了慢性移植损伤。关于肾缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）的研究,局限于24 hr以内的急性期和单一的观察时间点明显不够,因此,在本课题中选择了缺血再灌注6hr、24hr、3d、7d和21d作为观察时间点,以充分反应急性期和亚急性期的肾损伤情况。硫化氢（hydrogen sulfide, H2S）是继一氧化碳和一氧化氮之后的又一内源性气体信号分子,近年来H2S在体内的生物学效应受到广泛关注。最新研究表明其在机体内参与多种生物学功能调节,内源性H2S代谢异常与多种系统疾病,包括循环、消化、神经、呼吸等系统疾病发生关系密切。内源性H2S主要有两大来源：酶合成途径和非酶途径。酶合成途径是体内H2S的主要来源,通过体内的半胱氨酸5-磷酸毗哆醛依赖性的酶—胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-1-cynthase, CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase,CSE）催化产生H2S。CBS和CSE的表达具有组织特异性,肾脏中同时存在CBS和CSE表达,且H2S合成水平较高。然而关于内源性H2S在肾脏生理与病理生理过程中的作用至今报道很少,且主要围绕高血压肾病和糖尿病肾病。本课题组前期报道了H2S对糖尿病肾病具有保护作用,明确糖尿病早期CSE表达减少,与高糖引起的肾脏组织氧化应激发生有关。在离体培养的肾小球系膜细胞中,外源性给予NaHS （H2S供体）可抑制高糖引起的活性氧增多。活性氧生成增加是缺血再灌注致器官损伤的共同特征和重要机制。关于H2S在I/R中的作用,已有的文献报道,在心血管系统中,特别是心肌缺血再灌注中,H2S能缓解心肌损害,然而,在肾脏缺血再灌注过程中,内源性H2S生成有何变化,H2S能否通过缓解肾脏I/R氧化应激的发生而发挥保护作用,如果H2S能有保护作用,其在体内的作用途径和具体机制是什么等都是我们在本课题中关心的问题。肾小球系膜细胞（mesangial cells, MCs）是肾小球内一种固有的血管外周细胞,具有舒缩功能,参与肾小球血流量的调节。目前已有大量实验研究证实,MCs的异常增殖、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的合成和分泌异常升高是肾小球硬化最重要的原因。以往对I/R的损伤研究集中于肾小管细胞,但在我们的实验中明确观察到,I/R可引起肾脏炎症因子和纤维化相关细胞因子的表达成倍上调,且肾皮质的变化早于髓质,提示肾小球固有细胞可能在其中发挥作用。2010年Kim的报道也提示,在RIRI的发生机制中,肾脏的不同细胞可以表现出不同的应答模式。然而,关于MCs是否参与RIRI,特别是急性期过后的肾损伤则没有明确答案。因此,本课题中,我们结合整体动物模型的观察结果,选择肾小球系膜细胞作为离体研究的对象,采用缺氧-复氧模型开展研究。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是指内质网受到诸如缺血、缺氧、钙超载、ATP耗竭等应激刺激,导致内质网内未折叠蛋白、错误折叠蛋白堆积等引发内质网乃至细胞功能紊乱的状态。ERS是细胞的一种自我保护性机制,适度的ERS可通过激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）来保护由ERS所引起的细胞损伤,恢复细胞功能。但过强或时间过长的ERS则将诱导一系列细胞因子的大量释放,甚至启动细胞凋亡机制最终导致细胞凋亡。肾缺血和再灌注可引起细胞内质网应激发生,后者又与肾缺血再灌注损伤的发生、发展和预后密切相关。一方面有研究表明,缺血再灌注可启动强烈的内质网应激反应,并激活细胞凋亡途径；但同时,翼志勇等报道,通过预处理诱导内质网应激发生可有效减少I/R引起的肾损伤。ERS作为一把双刃剑,是参与I/R的损伤机制还是在其中发挥保护作用,硫化氢对ERS又有何作用等也是本课题所关心的问题。由此,本论文由三部分组成：一、缺血再灌注损伤过程中内源性H2S生成改变及给予外源性H2S对缺血再灌注肾损伤的缓解作用1.本课题研究采用夹闭大鼠肾动脉造成肾双侧缺血,60 min后恢复血供进行再灌注的肾脏缺血再灌注动物模型。首先于缺血再灌注后6 hr观察到肾皮质H2S浓度低于假手术组,但肾髓质尚无变化。外源性给予NaHS （100μg/kg）对假手术大鼠血肌酐、尿素氮无影响,也不引起正常大鼠肾脏的形态学改变。2.实验共收集5个时间点的动物样本,分别为再灌注后6hr、24hr、3d、7d和21 d,收集样本包括24小时尿液、血清和肾脏组织。。肾功能和尿蛋白结果显示,肾缺血再灌注后6hr, I/R组血肌酐、尿素氮已显著升高,随时程延长,虽有缓解,但血肌酐、尿素氮数值始终高于假手术组。HE染色同样提示肾脏存在病理改变。3.肾组织缺血后50 min,即再灌注前10 min,腹腔注射NaHS,作为I/R+NaHS组。对该组大鼠肾功能、尿蛋白和病理形态学观察的结果显示,肾缺血再灌注后的急性期内,即6 hr和24 hr的肾脏功能和形态学改变与I/R组一致,但7d和21d时都显著优于I/R组,提示再灌注前外源性给予H2S可以改善缺血再灌注肾脏亚急性期的损伤效应。4.炎症因子的异常启动,肾脏组织出现非特异性炎症反应是造成再灌注损伤的重要因素,其中白介素6（interleukin 6, IL-6）是参与肾脏非特异性炎症反应的重要炎症因子之一。本实验中检测了大鼠血清IL-6水平,观察到缺血再灌注6 hr后,I/R与I/R+NaHS组血清IL-6水平均有显著上升,较假手术组高出近3倍,此后,IL-6水平下降,但I/R组仍持续高于假手术组,而I/R+NaHS组则从24 hr起即与假手术组无差别。。肾脏皮质IL-6 mRNA水平I/R组在5个观察时间点都显著升高,峰值出现在24 hr,约为假手术组的8倍。I/R+NaHS组肾皮质IL-6表达水平也显著升高,但低于I/R组。肾脏髓质IL-6表达水平I/R组与I/R+NaHS组在缺血再灌注后6 hr都无明显变化。I/R组从24 hr点起,表达水平显著升高,3d时达高峰,可达假手术组的6倍。I/R+NaHS组自3d起,也观察到IL-6 mRNA表达上调,但低于I/R组。上述结果提示,肾组织IL-6水平在肾缺血再灌注后出现明显的升高,且主要来源并非血液循环。肾皮质的表达水平升高早于髓质。给予外源性H2S能部分抑制IL-6生成的增多,减轻非特异性炎症反应。单核细胞趋化因子（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）是趋化因子家族的重要成员,在肾损害中起着重要作用。本实验中也观察了肾皮质MCP-1的表达水平,其在I/R组和I/R+NaHS组表现出了与IL-6同样的变化趋势,进步确认了I/R可引起组织局部非特异性炎症反应的发生,及H2S能抑制该反应的效应。5.肾脏纤维化是导致肾功能减退的重要病理改变之一。转化生长因子（transforming growth factor-β, TGF-β）是促进纤维化的重要细胞因子。本实验中检测了肾皮质TGF-β的mRNA水平,观察到24 hr I/R与I/R+NaHS组TGF-β表达水平并未出现明显变化。但3d起,表达水平显著升高,I/R组TGF-βmRNA水平约为假手术组的8倍,I/R+NaHS组则显著低于I/R组。纤维粘连蛋白（fibronectin, FN）是TGF-β重要的下游效应分子,也是肾组织重要的细胞外基质成分,与TGF-β共同参与了肾纤维化的进程。本实验中观察到肾皮质FN mRNA水平在I/R组和I/R+NaHS组表现出与TGF-β相一致的变化趋势,提示肾脏在缺血再灌注急性期过去后,可出现纤维化相关基因的表达上调,这可能是远期肾脏发生纤维化并引起肾功能减退的重要原因。而外源性给予H2S能显著抑制上述基因的表达上调,提示H2S将可能有助于缓解肾纤维化的发生与发展以及继发的慢性肾功能损伤。二、H2S抑制I/R引起的组织活性氧生成及缺氧-复氧引起的系膜细胞功能变化1.肾缺血再灌注后6 hr、24 hr、3d、7 d和21d分别收集肾脏组织,匀浆后以lucigenin为探针,用化学发光技术定量测定组织活性氧水平。结果显示,肾缺血再灌注引起肾组织内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高,外源性给予硫化氢可抑制ROS生成的增多。2.课题研究选择离体培养肾脏系膜细胞作为细胞水平研究的对象,将细胞置于缺氧试剂盒中培养2 h,然后恢复常氧继续培养,建立缺氧-复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）细胞模型,模拟机体缺氧／再灌注损伤模型。利用DCFH-DA荧光探针进行细胞水平活性氧检测,观察到缺氧2h后复氧时,细胞ROS水平显著升高,随后下降,在复氧2h恢复至对照水平,继而再次升高,在6h达峰值,并于12 h再次恢复至对照水平。采用缺氧前和复氧初两次给予NaHS （30μM）,可抑制H/R引起的ROS生成增多。仅缺氧前给予NaHS预处理,虽然对复氧初的ROS增多有一定抑制作用,但对后继出现的第二次ROS水平升高无显著影响。若仅在复氧后给予NaHS,则可明显抑制第二次ROS生成高峰,提示H/R引起的ROS增多可出现两次高峰,其中缺氧可能与第一次高峰的出现有关,而复氧引起ROS第二次高峰。因此,复氧后给予NaHS处理可抑制ROS生成的第二个高峰。3.H/R引起系膜细胞IL-6 mRNA表达增加,培液IL-6水平升高,在复氧初给予NaHS,可显著抑制上述效应,提示在细胞水平,H2S也抑制了非特异性炎症反应。另外,NaHS还可抑制H/R引起的系膜细胞增殖效应。由于肾小球硬化,肾脏纤维化等病理变化中,系膜细胞过度增殖及分泌的细胞因子都起了重要作用,因此,NaHS抑制H/R引起的IL-6水平升高和系膜细胞的增殖作用,在整体上可能是其改善肾缺血再灌注后肾损伤的细胞机制之一。4.实验中给予NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘（diphenylenechloride iodonium,DPI）后,可完全抑制H/R引起的ROS增多,提示H/R引起的ROS生成增加主要来自NADPH氧化酶代谢途径。给予DPI处理也抑制了H/R引起的IL-6 mRNA表达上调和系膜细胞增殖效应,提示IL-6的生成和细胞的增殖是由ROS生成增加所致。三、肾缺血再灌注激活内质网应激1.肾缺血再灌注后,肾组织可观察到内质网应激的标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78 （glucose regulating protein 78, GRP78）水平显著升高。在细胞水平,缺氧-复氧引起系膜细胞GRP78蛋白水平和真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α）磷酸化水平升高,提示肾脏缺血再灌注或细胞缺氧-复氧可引起内质网应激反应发生。2.给予外源性H2S抑制了24 hr时间点观察到的缺血再灌注引起的组织内质网应激及缺氧-复氧后12 hr时间点时所观察到的系膜细胞内质网应激反应。在离体培养的系膜细胞中,单纯给予NaHS不影响正常细胞内质网应激水平。3.在系膜细胞上给予ERS诱导剂毒胡萝卜素（thapsigargin, TG）或衣霉素（tunicamycin,TM）诱发内质网应激,用NaHS预处理对TG或TM引起的GRP78蛋白水平和eIF2α磷酸化水平无影响,提示硫化氢本身对内质网应激可能无明显直接抑制效应,其抑制肾缺血再灌注或缺氧-复氧引起的内质网应激可能与其抑制内质网应激上游刺激因子,如ROS、炎症因子等的生成有关。综上所述,本研究详细观察了肾缺血再灌注后早期肾脏功能、形态学、组织局部ROS、炎症因子和纤维化相关细胞因子水平的变化过程,为寻找和阐明肾功能障碍的早期发生机制提供了有意义的实验依据。课题中观察到硫化氧可抑制缺血再灌注肾组织的活性氧升高,减少组织局部的炎症因子和纤维化相关细胞因子的表达,这对于进一步揭示硫化氢本身的生物学作用以及对其在改善肾脏损伤中的机制研究和临床应用都有十分重要的意义。实验中通过细胞水平缺氧-复氧模型观察,与在整体动物缺血再灌注模型上的研究结果相结合,使研究结果较单一水平上得出的结论更为明确。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 2S生成改变及给予外源性H₂S对缺血再灌注肾损伤的缓解作用'>第一部分 缺血再灌注损伤过程中内源性H₂S生成改变及给予外源性H₂S对缺血再灌注肾损伤的缓解作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 硫化氢抑制缺血再灌注引起的组织活性氧生成及缺氧-复氧引起的系膜细胞功能变化
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 肾缺血再灌注激活内质网应激
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 就读期间发表论文
• 附录二 综述
• 参考文献
• 附录三 就读期间其他实验工作整理成文