木鳖子皂甙及油佐剂混合物的免疫佐剂作用研究

论文摘要

疫苗免疫是预防动物传染病的一个重要手段。佐剂是疫苗一个重要成分。迄今人们已经发现许多物质具有佐剂活性,但是只有少数被许可在实际中使用。许多具有免疫佐剂活性的物质由于其毒性作用而限制了实际应用。为了寻找低毒的高效新佐剂,我们对木鳖子提取物（Extraction of Cochinchina Momordica Seed, ECMS）在促进体液免疫和细胞免疫方面的佐剂作用进行了研究。为了探讨ECMS的佐剂活性,以小鼠、豚鼠、猪、鸡为实验动物,研究ECMS对不同动物对于模式抗原卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）、口蹄疫、禽新城疫灭活油佐剂疫苗的免疫反应的影响。同时还进行皂树皂甙Quil A对小鼠、猪对于O型口蹄疫灭活油佐剂疫苗免疫反应的影响的研究。1.木鳖子提取物（ECMS）的制备及其理化性质与毒性研究。本研究主要采用乙醇回流法提取ECMS,提取过程中用活性淀粉去除杂质,所用方法提取ECMS的平均得率为2.077g／kg。ECMS主要集中在果仁中。用醋酐-浓硫酸反应,薄层色谱分析,表面活性试验,紫外光谱分析方法确定其主要化学成分为三萜皂甙。鲎试验检测表明ECMS的内毒素含量低于0.5内毒素单位（EU）／毫升,排除了实验过程中内毒素对实验结果的干扰。ECMS对于猪、羊及牛红细胞的最低溶血浓度为125μg／ml左右,ECMS与Quil A相比,其溶血活性低,毒性小。ECMS急性毒性试验结果,静脉注射的半数致死量（Median lethal dose, LD50）为108.05mg／kg,肌肉注射的LD50为178.09mg／kg。2.ECMS提高小鼠对模式抗原卵清白蛋白（OVA）免疫反应的研究。选取雌性ICR小鼠为实验动物,研究ECMS对小鼠对于OVA抗原的免疫反应的影响。30只小鼠随机分成如下5组（n=6）:1)OVA；2)OVA+10μg ECMS；3)OVA+50 u g ECMS；4)OVA+100μg ECMS；5)OVA+50μg铝胶。分别在第1,第21天进行两次免疫,并在二免后2周眼眶采血和分离脾细胞。结果显示,与对照组相比ECMS可以显著提高小鼠对OVA的体液免疫反应和细胞免疫反应。ECMS 100μg剂量组的血清抗OVA抗体效价显著高于对照组（P<0.01）；ECMS 100μg剂量组小鼠血清中OVA特异性IgGl抗体水平显著高于OVA对照组（P<0.05）。三个ECMS试验组之间随着剂量的增大,小鼠OVA特异性IgG1抗体水平随之增大。ECMS（50.100μg）.Al（OH）3对照组免疫小鼠血清中OVA特异性IgG2a抗体水平极显著高于OVA对照组（P<0.01）。与铝胶佐剂组相比,ECMS 50μg体外能显著促进ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应（P<0.05）。3.ECMS提高豚鼠对灭活0型口蹄疫病毒（FMDV）免疫反应的研究。进行ECMS对豚鼠对于灭活O型口蹄疫病毒免疫反应的研究。30只雌性DHP花豚鼠随机分成5组（n=6）,分别免疫：1)口蹄疫O型灭活抗原+100μg ECMS组；2)口蹄疫O型灭活抗原+100μg ECMS+350μl矿物油组；3)口蹄疫O型灭活抗原+350μl矿物油组；4)口蹄疫O型灭活抗原组；5)生理盐水组。每只豚鼠每次肌肉注射疫苗0.5ml,注射2次,间隔3周。分别于免疫前和免疫后2,4,6周采血分离血清,采用间接双抗夹心ELISA法检测豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体及抗体亚类,检测抗口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗体水平,在二免后4周检测抗VP1亚类IgG1和IgG2。结果,二免后2,4,6周豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体水平呈下降趋势,其中ECMS-矿物油组、矿物油组比其他组诱导出更高的抗O型口蹄疫病毒抗体水平,差异显著（P<0.05）。二免后2,4,6周血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类IgGl水平属ECMS-矿物油组最高,其次为矿物油组,两组均与其他组呈差异显著（P<0.05）；在二免后4,6周,ECMS-矿物油组和矿物油组的豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体亚类IgGl有显著差异（P<0.05）。二免后2,4,6周豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类IgG2水平属ECMS-矿物油组最高,并在二免后4周达到最高,与各组有显著性差异（P<0.05）。二免后2,4周ECMS-矿物油组比其他组可以诱导出更高的抗口蹄疫病毒VP1抗体水平。二免后4周ECMS-矿物油组及矿物油组比其他组在豚鼠抗口蹄疫病毒VP1抗体IgG2上均有显著性差异（P<0.05）。ECMS与矿物油有佐剂协同作用,并能够提高豚鼠对于O型口蹄疫病毒的免疫反应。4.皂树皂甙（QuilA）提高灭活油佐剂口蹄疫（O型）疫苗免疫反应的研究。进行Quil A对小鼠和猪对于灭活O型口蹄疫油佐剂疫苗免疫反应的研究。试验A,将雌性ICR小鼠40只随机分成4组（n=10）,所有的小鼠免疫两次,间隔三周。分别免疫1)OVA抗原组；2)OVA抗原+50μg Quil A组；3)100μ1矿物油组；4)OVA抗原+50μg Quil A+100μl矿物油组。试验B,将雌性ICR小鼠18只随机分成3组（n=6）。所有的小鼠免疫0型口蹄疫抗原或疫苗两次,间隔二周。试验C,选择母源抗体低的试验猪20头随机分成2组（n=10）。在40日龄免疫2ml商品苗或者2ml商品苗+1mg Quil A。A结果表明所有佐剂组的抗OVA总抗体均显著高于对照组（P<0.01）。QuilA-矿物油组的抗OVA总抗体与QuilA组和矿物油组又有显著性差异（P<0.01）。在IgGl、IgG2a及IgG3中,所有佐剂组的抗OVA抗体亚类均显著高于对照组（P<0.01）。QuilA-矿物油组的抗OVA抗体亚类与QuilA组和矿物油组有显著性差异（P<0.01）。B结果,二免后小鼠血清中抗O型FMDV抗体以商品苗+Quil A组高,与生理盐水组和商品苗组均呈差异显著（P<0.05）。二免后小鼠血清中抗O型FMDV抗体亚类均以商品苗+Quil A组高,在IgGl,IgG3和IgG2a中,商品苗+Quil A组与生理盐水组和商品苗组均呈差异显著（P<0.05）。C结果Quil A组抗体水平显著高于对照组（P<0.05）.Quil A能够显著提高猪O型口蹄疫灭活疫苗对于猪的免疫效果。5. ECMS提高灭活油佐剂口蹄疫（0型）疫苗免疫反应的研究。进行ECMS对于灭活O型口蹄疫油佐剂疫苗免疫反应的研究。试验A、B,24头大长猪（免疫前IHA抗体滴度低于27／高于27）,随机分成4组（n=6）。每一头猪免疫2ml的O型口蹄疫商品苗并且混合（0,1,2和4 mg每头份剂量的ECMS）。分别于免疫前和免疫后三周采血,用正向间接血凝法检测血清中抗O型口蹄疫病毒抗体。试验C,36头大长猪（免疫前IHA抗体滴度低于27）,随机分成2组（n=18）。每一头猪免疫2m1的O型口蹄疫商品苗并且混合（0或者4 mg每头份剂量的ECMS）.分别于免疫前和免疫后3、7周采血,检测IHA抗体。同时在免疫后7周检测外周血淋巴细胞转化能力。试验D,24头大长猪（且免疫前IHA抗体滴度低于27）,随机分成2组（n=12）。每一头猪免疫2ml的O型口蹄疫商品苗并且混合（0或者4 mg每头份剂量的ECMS）.分别于免疫前和免疫后3、6周采血,检测抗FMDV VP1抗体及抗体亚类。结果表明,ECMS可以提高猪O型口蹄疫灭活疫苗对猪的体液及细胞免疫反应。其中最佳剂量为4mg ECMS（P<0.05）.6. ECMS提高鸡对灭活鸡新城疫疫苗的免疫反应的研究。进行ECMS对于灭活禽新城疫灭活油佐剂疫苗免疫反应的研究。选取海兰雏公鸡48羽,随机分成4组（n=12）。从组一到组四分别混合0μg,20μg,40μg,80μgECMS每羽剂量于新城疫灭活疫苗。分别于免疫前和免疫后1,2,3,4,5周采血,检测抗体。同时于免疫后5周检测外周血淋巴细胞转化能力。结果,在免疫后2周,免疫鸡只体内抗新城疫抗体水平开始出现升高。其中80μg剂量组ECMS效果最为明显。在免疫后3周,所有组的抗体水平相比于免疫后2周有上升趋势,并且80μg剂量组抗体水平显著高于40μg,20μgECMS组（P<0.01）。在免疫后5周,不同剂量ECMS的细胞免疫水平无显著性差异,但是,80μg剂量组刺激指数略高于其他剂量组。ECMS可以提高鸡对于鸡新城疫灭活油佐剂疫苗的免疫反应。因此,采用本研究提取方法从中药木鳖子获得的提取物ECMS为一种三萜皂甙。ECMS对于猪、羊及牛红细胞的最低溶血浓度为125μg／ml左右。静脉注射ECMS的LD50为108.05mg/kg;肌肉注射ECMS的LD50为178.09mg／kg。作为佐剂用于肌肉注射是安全的。ECMS具有佐剂作用,可以提高ICR小鼠对于OVA免疫的免疫反应水平,ECMS对IgG2a促进作用高于IgGl的作用。皂树皂甙QuilA或者ECMS与油佐剂混合后产生组合效应,比两者单独应用产生更强的佐剂效果。ECMS或者Quil A和商品灭活油佐剂O型口蹄疫疫苗或禽新城疫疫苗混合免疫动物,可以提高免疫效果。

论文目录

摘要

Abstract

文献综述部分

第一章疫苗佐剂研究进展

1 免疫和疫苗

1.1 免疫的概念

1.1.1 天然免疫

1.1.2 自然杀伤细胞

1.1.3 巨噬细胞与树突状细胞

1.1.4 干扰素

1.1.5 Toll受体

1.1.6 适应性免疫

1.1.7 体液免疫

1.1.8 细胞免疫

1.2 疫苗

2 佐剂

2.1 佐剂的作用机理

2.1.1 形成抗原贮库

2.1.2 作用于抗原提呈

2.1.3 诱导T细胞免疫应答

2.1.4 靶向作

3 常见疫苗佐剂

3.1 铝佐剂

3.2 油佐剂

3.2.1 弗氏佐剂

3.2.2 MF—59

3.3 免疫刺激复合物（Immunost imulating Compl exes,Iscoms）

3.4 脂质体

3.5 天然动植物来源佐剂

3.5.1 蜂胶佐剂

3.5.2 皂甙Quil A、QS-21

3.5.3 中药佐剂

第二章木鳖子的药用功能和临床应用

1 木鳖子来源

2 木鳖子的化学成分研究

2.1 脂肪酸类

2.2 皂甙

2.3 活性蛋白类

2.4 其他成分

3 木鳖子的药理毒理作用

4 临床应用

实验部分

第一章木鳖子提取物（ECMS）的制备及其理化性质研究

1 引言

2 材料

2.1 药材

2.2 试剂

2.3 仪器

3 方法

3.1 木鳖于提取物（ECMS）的制备

3.2 醋酐—浓硫酸反应

3.3 薄层色谱分析

3.4 表面活性

3.5 紫外光谱分析

4 结果

4.1 ECMS的得率

4.2 醋酐—浓硫酸反应（Liebermann-Burchard reaction）

4.3 薄层色谱分析

4.4 表面活性

4.5 紫外光谱分析

5 讨论

6 小结

第二章 ECMS的毒性作用

1 引言

2 材料

2.1 ECMS

2.2 动物血细胞

2.3 实验动物

2.4 仪器材料

3 方法

3.1 ECMS的溶血作用

3.2 ECMS的急性毒性试验

3.2.1 ECMS静脉注射LD50的测定

3.2.2 ECMS肌肉注射LD50的测定

3.2.3 统计分析

4 结果

4.1 ECMS的溶血作用

4.2 ECMS LD50试验结果

5 讨论

6 小结

第三章 ECMS提高小鼠对模式抗原卵清白蛋白（OVA）免疫反应的研究

1 引言

2 材料

2.1 试验动物

2.2 抗原

2.3 佐剂

2.4 细菌内毒素检测用试剂

2.5 抗体

2.6 主要试剂及配制

2.7 仪器

3 方法

3.1 ECMS溶液的配制

3.2 分组和免疫

3.3 IgG效价的测定

3.4 抗体亚类的测定

3.5 淋巴细胞增殖能力的测定

3.6 统计分析

4 结果

4.1 ECMS对小鼠增重的影响

4.2 ECMS对小鼠血清抗OVA抗体效价的影响

4.3 ECMS对小鼠血清中OVA特异性抗体亚类IgG1,IgG2a的影响

4.4 体外对ConA,LPS,OVA诱导小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响

5 讨论

6 小结

第四章 ECMS提高豚鼠对灭活O型口蹄疫病毒（FMDV）免疫反应的研究

1 引言

2 材料

2.1 试验动物

2.2 抗原

2.3 佐剂

2.4 免疫学试剂

2.5 主要仪器

3 方法

3.1 动物分组与免疫

3.2 间接双抗夹心ELISA法检测豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体

3.3 间接双抗夹心ELISA法检测豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类

3.4 间接ELISA法检测豚鼠血清中抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体

3.5 间接ELISA法检测豚鼠血清中抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体亚类

3.6 统计分析

4 结果

4.1 豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体

4.2 豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类

4.3 豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒VP1抗体

4.4 豚鼠血清中抗O型口蹄疫病毒VP1抗体亚类

5 讨论

6 小结

第五章皂树皂甙（QuilA）提高灭活油佐剂口蹄疫（O型）疫苗免疫反应的研究

1 引言

2 材料

2.1 试验动物

2.2 抗原

2.3 佐剂

2.4 疫苗

2.5 免疫学试剂

2.6 仪器

3 方法

3.1 分组和免疫

3.2 间接ELISA法检测小鼠血清中抗OVA总抗体

3.3 间接ELISA法检测小鼠血清中抗OVA IgG1,IgG2a,IgG2b和IgG3抗体水平

3.4 间接双抗夹心ELISA法检测血清中抗0型口蹄疫病毒抗体

3.5 间接双抗夹心ELISA法检测血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类

3.6 正向间接血凝法检测血清中抗0型口蹄疫病毒抗体

3.7 统计分析

4 结果

4.1 二免后血清中抗OVA总抗体

4.2 二免后血清中抗OVA抗体亚类

4.3 二免后血清中抗O型口蹄疫病毒总抗体

4.4 二免后血清中抗O型口蹄疫病毒抗体亚类

4.5 O型口蹄疫疫苗免疫后猪血清IHA抗体水平

5 讨论

6 小结

第六章 ECMS提高灭活油佐剂口蹄疫（O型）疫苗免疫反应的研究

1 引言

2 材料

2.1 试验动物

2.2 佐剂

2.3 疫苗

2.4 免疫学试剂

2.5 仪器

3 方法

3.1 实验A

3.2 实验B

3.3 实验C

3.4 实验D

3.5 正向间接血凝法检测血清中抗O型口蹄疫病毒抗体

3.6 间接ELISA法检测猪血清中抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体

3.7 间接ELISA法检测猪血清中抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体亚类

3.8 免疫猪淋巴细胞转化试验

3.9 统计分析

4 结果

4.1 试验A,B,C的IHA抗体滴度

4.2 免疫猪淋巴细胞转化试验

4.3 猪血清中抗O型口蹄疫病毒VP1抗体

4.4 猪血清中抗O型口蹄疫病毒VP1抗体亚类

5 讨论

6 小结

第七章 ECMS提高鸡对灭活鸡新城疫疫苗的免疫反应的研究

1 引言

2 材料

2.1 试验动物

2.2 疫苗

2.3 佐剂

2.4 试剂

2.5 免疫学试剂

2.6 常规仪器

3 方法

3.1 分组与处理

3.2 ND抗体检测

3.3 外周血淋巴细胞转化试验

3.4 统计分析

4 结果

4.1 不同剂量ECMS佐剂组的ND抗体水平及抗体持续期

4.2 不同剂量ECMS佐剂组在免疫后5周的细胞免疫水平

4.3 ECMS对于体重的影响

5 讨论

6 小结

结论

创新点

展望

参考文献

致谢

博士生期间录用及发表文章及申请的专利一览表

木鳖子皂甙及油佐剂混合物的免疫佐剂作用研究

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