论文摘要
目的建立磷酸三邻甲苯酯（tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）诱导迟发性神经毒性（organophosphorus easter-induced delayed neurotoxicity，OPIDN）及受苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）保护的动物模型，利用萤光素酶生物发光法（firefly luciferase bioluminescence，FLB）测定成年罗曼母鸡中枢神经系统（central nervous system，CNS）和周围神经系统（peripheral nervous system，PNS）中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的含量，利用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）同时测定实验动物CNS和PNS中三种腺苷酸的含量并计算相应的能荷（energy charge，EC）值。通过研究提前应用PMSF对母鸡在TOCP诱发OPIDN过程中神经系统内能量状态变化的影响，进一步探讨TOCP诱发OPIDN的分子机制。方法1建立TOCP诱发OPIDN及受PMSF保护的的动物模型：成年罗曼母鸡80只，随机分为TOCP组（n=40）及PMSF+TOCP组（n=40），每组又随机分为染毒后d0、d5、d10、d15和d21组（n=8），其中TOCP组的d0组为正常对照组。PMSF+TOCP组40只动物，一次sc 60 mg／kg PMSF（溶于DMSO）；20h后，两个d0组以外的其它64只实验动物，一次po 750 mg／kg TOCP。在染毒后相应的时间点处理各组动物。2观察实验动物OPIDN症状：密切观察实验动物染毒前后一般状况的变化，每隔4d测量体重，每天观察其OPIDN症状并按8级评分标准进行评价。3测定实验动物神经组织中ATP的含量：利用FLB检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP含量。4测定实验动物神经组织中三种腺苷酸的含量并计算EC值：利用HPLC检测实验动物在各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经及胫腓神经组织中的ATP、ADP及AMP含量，并计算相应的EC值以进一步反映神经组织中的能量状态。结果1实验动物体重的变化TOCP组动物的体重，与正常对照组相比，染毒后随着时间进展有逐渐降低的趋势，其中染毒后d21降低了23.63％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组动物的体重，与其d0组相比，染毒后各个时间点均有降低但不具有统计学意义，其中以染毒后d5降低的幅度最大，为4.28％（P＞0.05）。2实验动物OPIDN症状的进展TOCP组动物在染毒后d5出现间或的双腿运动轻微不协调，d7出现明显的双腿运动中度不协调，d9出现严重的、频发的站立和行走困难；之后OPIDN症状进展迅速，从染毒后d12开始，动物出现双腿实质性至完全性的瘫痪，d21所有动物完全瘫痪。PMSF+TOCP组动物染毒后，与TOCP组动物相比，OPIDN症状出现明显延迟且进展相对缓慢：动物从染毒后d11开始出现间或的双腿运动轻微不协调，至d21也未出现双腿实质性的瘫痪。3 FLB检测实验动物神经组织中ATP含量的变化3．1大脑组织中ATP含量的变化TOCP组动物大脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10均有升高，其中染毒后d5升高了46.14％（P＜0.01）；d15、d21分别降低了20.67％（P＜0.01）、26.57％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组d0组动物大脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了18.09％（P＞0.05）。PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5升高了86.88％（P＜0.01）；d10、d15、d21均有降低，其中d15、d21分别降低了32.40％（P＜0.01）、33.33％（P＜0.01）。3．2小脑组织中ATP含量的变化TOCP组动物小脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10分别升高了86.75％（P＜0.01）、27.49％（P＜0.05）：d15、d21均有降低，其中d21降低了24.18％（P＜0.05）。PMSF+TOCP组d0组动物小脑组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了26.59％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组动物小脑组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5、d10分别升高了59.45％（P＜0.01）、24.23％（P＜0.01）；d15、d21分别降低了24.03％（P＜0.01）、33.28％（P＜0.01）。3．3脊髓组织中ATP含量的变化TOCP组动物脊髓组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d5、d10、d15分别升高了32.09％、38.48％、79.64％（均为P＜0.01）。PMSF+TOCP组d0组动物脊髓组织中ATP含量，与正常对照组相比，降低了4.55％（P＞0.05）。PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5、d10、d15均有升高，其中d10、d15分别升高了37.53％（P＜0.01）及13.06％（P＜0.05）；d21降低了16.30％（P＜0.01）。3．4坐骨神经组织中ATP含量的变化TOCP组动物坐骨神经组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5升高了161.53％（P＜0.01），d10、d15、d21分别降低了42.56％、36.53％、41.97％（均为P＜0.01）。PMSF+TOCP组d0组动物坐骨神经组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了325.26％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5、d10、d15、d21分别降低了84.24％、89.77％、86.69％、91.39％（均为P＜0.01）。3．5胫腓神经组织中ATP含量的变化TOCP组动物胫腓神经组织中ATP含量，与正常对照组相比，染毒后d5、d10、d15均有升高，分别升高了55.93％、29.20％、16.14％（均为P＜0.01）；d21降低了64.60％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组d0组动物胫腓神经组织中ATP含量，与正常对照组相比，升高了31.35％（P＜0.01）。PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中ATP含量，与其d0组相比，染毒后d5、d10、d15、d21分别降低了54.11％、46.38％、63.81％、75.80％（均为P＜0.01）。4 HPLC检测动物神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．1大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．1．1 TOCP组动物大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比，该组动物大脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10均有升高，其中d5升高了20.62％（P＜0.01），d15、d21分别降低了15.50％（P＜0.01）、17.96％（P＜0.01）；ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d5升高了18.73％（P＜0.01）；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中染毒后d15、d21分别升高了14.67％（P＜0.01）、21.60％（P＜0.01）；EC值在染毒后d5、d10均有升高，其中d5升高了11.24％（P＜0.01），d15、d21分别降低了9.86％（P＜0.01）、17.28％（P＜0.01）。4．1．2 PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物大脑组织中的ATP含量、ADP含量、AMP含量以及EC值，与正常对照组相比，均有升高，其中ADP含量升高了10.40％（P＜0.01）。与其d0组相比，PMSF+TOCP组动物大脑组织中ATP含量在染毒后d5升高了51.67％（P＜0.01），d10、d15、d21均有降低，其中d15、d21分别降低了18.41％（P＜0.01）、18.72％（P＜0.01）；ADP含量在染毒后d5、d10均有升高，其中d5升高了23.81％（P＜0.01），d15、d21分别降低了13.08％（P＜0.01）、13.34％（P＜0.01）；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d15、d21分别升高了4.54％（P＜0.01）、7.37％（P＜0.01）；EC值在染毒后d5升高了22.09％（P＜0.01），d10、d15、d21均有降低，其中d15、d21分别降低了13.84％（P＜0.01）、16.64％（P＜0.01）。4．2小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．2．1 TOCP组动物小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比，TOCP组动物小脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10分别升高了76.95％（P＜0.01）、20.36％（P＜0.05），d15、d21均有降低，其中d21降低了20.49％（P＜0.05）；ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d5、d10、d15分别升高了19.31％（P＜0.01）、18.05％（P＜0.01）、10.31％（P＜0.05）；AMP含量在染毒后d5、d10均稍有降低，d15、d21均有升高，其中d21升高了10.11％（P＜0.01）；EC值在染毒后d5、d10、d15均有升高，其中d5、d10分别升高了27.37％（P＜0.01）、12.31％（P＜0.01），d21降低了10.16％（P＜0.01）。4．2．2 PMSF+TOCP组动物小脑组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物小脑组织中ATP含量、AMP含量以及EC值，与正常对照组相比，均有升高，其中ATP含量升高了27.04％（P＜0.01），而ADP含量比正常对照组稍有降低。与其d0组相比，PMSF+TOCP组动物小脑组织中的ATP含量在染毒后d5、d10分别升高了45.98％（P＜0.01）、23.80％（P＜0.01），d15、d21分别降低了21.75％（P＜0.01）、33.89％（P＜0.01）；ADP含量在染毒后d5、d10分别升高了17.37％（P＜0.01）、10.24％（P＜0.01），d15、d21均稍有降低（P＞0.05）；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有降低，其中d5、d10、d15、分别降低了8.87％（P＜0.01）、6.37％（P＜0.05）、3.08％（P＜0.05）；EC值在染毒后d5、d10分别升高了24.59％（P＜0.01）、14.62％（P＜0.01），d15、d21均有降低，其中d21降低了10.73％（P＜0.01）。4．3脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．3．1 TOCP组动物脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比，TOCP组动物脊髓组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d5、d10、d15分别升高了32.45％、42.89％、87.10％（均为P＜0.01）；ADP含量在染毒各个时间点并没有出现显著的差异（P＞0.05），但染毒后d5、d15、d21均稍有升高，而d10稍有降低；AMP含量在染毒后d5、d10、d15均有降低，其中d10、d15分别降低了13.15％（P＜0.05）及27.87％（P＜0.01），d21稍有升高（P＞0.05）；EC值，在染毒后d5、d10、d15、d21均有升高，其中d5、d10、d15分别升高了13.61％、16.73％、32.56％（均为P＜0.01）。4．3．2 PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物脊髓组织中ATP含量、ADP含量以及EC值，与正常对照组相比，均稍有降低了（P＞0.05），AMP含量比正常对照组稍有升高（P＞0.05）。与其d0组相比，PMSF+TOCP组动物脊髓组织中ATP含量在染毒后d5、d10、d15均有升高，其中d10、d15分别升高了35.81％（P＜0.01）及15.24％（P＜0.01），d21降低了12.90％（P＜0.01）；ADP含量在染毒后d5稍有升高（P＞0.05），d10、d15 d21均有降低，其中d10降低了7.13％（P＜0.05）；AMP含量在染毒后d5、d10、d15均有降低，其中d10降低了13.99％（P＜0.05），d21升高了18.52％（P＜0.05）；EC值在染毒后d5、d10、d15均有升高，其中d10升高了15.66％（P＜0.01），d21降低了10.77％（P＜0.05）。4．4坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．4．1 TOCP组动物坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比，TOCP组动物坐骨神经组织中的ATP含量在染毒后d5升高了130.24％（P＜0.01），d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了30.65％、28.31％、30.15％；ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21分别升高了121.74％（P＜0.01）、3.35％（P＜0.05）、32.11％（P＜0.01）、31.57％（P＜0.01）；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高（P＜0.01），分别升高了96.16％、72.07％、130.61％、127.09％；EC值在染毒后d5升高了8.34％（P＜0.01），d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了36.10％、41.38％、41.15％。4．4．2 PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物坐骨神经组织中ATP含量、ADP含量、AMP含量以及EC值，与正常对照组相比，均有显著升高（P＜0.01），分别升高了347.90％、153.70％、70.88％、47.15％。与其d0组相比，PMSF+TOCP组动物坐骨神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了82.87％、87.22％、84.55％、87.14％；ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了43.19％、52.17％、46.78％、43.94％；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高（P＜0.01），分别升高了27.65％、33.24％、53.99％、101.54％；EC值在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了56.00％、63.37％、63.78％、70.87％。4．5胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化4．5．1 TOCP组动物胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化与正常对照组相比，TOCP组动物胫腓神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15均有显著升高（P＜0.01），分别升高了47.49％、23.42％、14.32％，d21降低了44.63％（P＜0.01）；ADP含量在染毒后d5、d10、d15分别升高了30.96％（P＜0.01）、9.80％（P＜0.01）、4.60％（P＜0.05），d21降低了33.35％（P＜0.01）；AMP含量在染毒后d5、d10、d21均有升高，其中d5、d21分别升高了12.67％（P＜0.01）、17.96％（P＜0.01），d15稍有降低；EC值在染毒后d5、d10、d15均有显著升高（P＜0.01），分别升高了13.60％、7.50％、6.47％，d21降低了36.66％（P＜0.01）。4．5．2 PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中ATP、ADP、AMP含量及EC值的变化PMSF+TOCP组d0组动物胫腓神经组织中ATP含量及EC值，与正常对照组相比，分别升高了5.16％（P＜0.01）、6.81％（P＜0.01），ADP含量及AMP含量比正常对照组分别降低了6.05％（P＜0.01）、10.96％（P＜0.01）。与其d0组相比，PMSF+TOCP组动物胫腓神经组织中的ATP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了34.01％、42.82％、39.08％、49.72％；ADP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了11.25％、12.05％、17.01％、27.39％；AMP含量在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著升高（P＜0.01），分别升高了13.71％、20.25％、22.09％、40.90％；EC值在染毒后d5、d10、d15、d21均有显著降低（P＜0.01），分别降低了21.67％、27.56％、29.26％、43.45％。结论1单独给母鸡染TOCP能够导致动物在表现出明显的OPIDN症状之前，其神经系统的ATP含量及EC值即发生显著的升高，但在本次实验观察终点即当动物完全瘫痪时均有不同程度的降低，且以PNS中降低的幅度为最大。2提前给母鸡应用PMSF能够延迟由TOCP诱发的OPIDN症状的出现并减慢其进展，同时能够改变动物染毒后其神经系统内尤其是PNS内ATP含量及EC值的变化程度和变化趋势。3单独给母鸡应用PMSF，可以显著提高动物PNS内的ATP含量及EC值，但受PMSF保护的动物在染TOCP d5其PNS内的ATP含量及EC值即出现显著的降低，且这种低的能量水平一直持续到本次实验观察终点。4单独染TOCP所导致的在染毒后d5母鸡神经系统内ATP含量及EC值所出现的显著性升高可能是其所致OPIDN症状出现的一个重要预示，也可能TOCP诱发OPIDN过程中其它病理变化出现的原因。提前给动物应用PMSF可能正是通过阻止染TOCP后d5动物PNS内这种能量水平的暂时升高而对动物起到保护作用。
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