番茄和辣椒翻译起始因子4E相关基因的克隆与分析

论文摘要

植物病毒是导致粮食、油料、蔬菜、果树、花卉产量下降和品质变劣的重要原因,番茄和辣椒是我国重要的蔬菜作物,在生产上严重遭受植物病毒病的侵害,造成生产上的损害。随着植物翻译起始因子的深入研究,植物抗病毒研究将面临新的课题。病毒侵染寄主植物并在植物体内进行自我复制和增殖需要借助寄主自身蛋白质合成机制。研究发现真核翻译起始因子4E在植物抗病毒中起作用,番茄和辣椒中eIF4E和eIF（iso）4E的基因都对马铃薯Y病毒属病毒有抗性。通过植物基因工程途径,干扰病毒利用植物mRNA翻译蛋白质的过程,可抑制病毒在寄主植物内的复制和增殖,不仅可获得抗病毒植物材料,而且可加深对植物-病毒互作分子机理的认识。本研究通过克隆真核翻译起始因子4E相关基因,利用基因失活和正义表达顺式调控植物自身eIF4E和eIF（iso）4E表达,提高植物对病毒的抗性,探讨真核翻译起始因子4E相关基因介导的抗病毒特性的作用机理。1.从番茄品种“中蔬五号”中克隆了真核翻译起始因子4E编码基因。分析表明,番茄eIF4E基因全长cDNA长696bp,该克隆片段含有长687bp的开放读码框,编码228个氨基酸,与报导的AY723735核酸序列同源性为98%,氨基酸序列同源性为100%。2.构建了番茄eIF4E正义表达载体及番茄eIF4E反义抑制表达载体。3.以番茄品种“中蔬五号”为受体,通过农杆菌介导的方法用番茄eIF4E正义载体进行遗传转化,获得番茄正义表达载体卡那霉素抗性植株13株,番茄eIF4E反义抑制表达载体卡那霉素抗性植株4株。4.从辣椒品种“苏椒5号”中克隆辣椒的真核翻译起始因子4E编码基因。经分析表明,辣椒eIF4E基因全长cDNA长875bp,克隆片段含有长687bp的开放读码框,编码228个氨基酸,与报导的AF521963核酸序列同源性为100%,氨基酸序列同源性为100%。5.构建了辣椒eIF4E正义表达载体及辣椒eIF4E反义抑制表达载体。6.从番茄品种“中蔬五号”中克隆了番茄eIF（iso）4E编码基因。番茄eIF（iso）4E基因全长cDNA长840bp,克隆片段含有长603bp的开放读码框,编码200个氨基酸,与报导的BT014561核酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为100%。7.构建了番茄eIF（iso）4E正义表达载体及番茄eIF（iso）4E反义抑制表达载体。8.以番茄品种“中蔬五号”为受体,通过农杆菌介导的方法用番茄eIF（iso）4E正义表达载体和番茄eIF（iso）4E反义抑制载体进行遗传转化,获得番茄eIF（iso）4E正义表达载体卡那霉素抗性植株5株。获得番茄eIF（iso）4E反义抑制表达载体卡那霉素抗性植株3株。9.从辣椒品种“苏椒5号”中克隆辣椒的eIF（iso）4E编码基因。分析表明,辣椒eIF（iso）4E基因全长cDNA长856bp,克隆片段含有长609bp的开放读码框,编码202个氨基酸,与TC5256核酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为100%。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1.前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 病毒病对植物的危害
• 1.2.1 植物病毒的分类
• 1.2.2 植物病毒传播方式
• 1.2.3 植物病毒的症状及鉴定
• 1.3 植物抗病毒的作用方式
• 1.4 植物抗病毒基因工程研究进展
• 1.4.1 病毒来源的抗性基因策略
• 1.4.1.1 外壳蛋白基因介导的抗性
• 1.4.1.2 利用病毒复制酶基因的抗性
• 1.4.1.3 运动蛋白基因
• 1.4.1.4 RNA介导的抗性策略
• 1.4.2 非植物病毒基因介导的抗性策略
• 1.4.2.1 α、β干扰素基因
• 1.4.2.2 利用核酶基因抗性策略
• 1.4.2.3 植物自身基因介导的抗病毒基因策略
• 1.5 真核翻译起始因子4E介导的抗病毒机理
• 1.5.1 真核翻译起始因子4E
• 1.5.1.1 eIF4E的结构及功能
• 1.5.1.2 eIF4E的调节机制
• 1.5.1.3 eIF4E家族
• 1.5.2 真核细胞蛋白质翻译起始机制
• 1.5.3 真核翻译起始因子4E抗病毒机制
• 1.5.3.1 马铃薯Y病毒属病毒基因组
• 1.5.3.2 马铃薯Y病毒属病毒选择利用eIF4E家族成员
• 1.5.4 植物真核翻译起始因子4E研究进展
• 1.6 本研究的目的与内容
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及试剂
• 2.3 利用生物信息学分析番茄和辣椒中e IF4E及eIF（iso）4E基因
• 2.4 基因数字表达分析
• 2.5 基因克隆及载体构建
• 2.5.1 引物设计和序列分析
• 2.5.2 反转录PCR
• 2.5.2.1 总RNA的提取
• 2.5.2.2 RNA的快速检测
• 2.5.2.3 RT-PCR
• 2.5.3 基因组织/器官特异性表达分析
• 2.5.4 植物表达载体构建
• 2.6 番茄遗传转化
• 2.7 转基因植株的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 利用生物信息学分析番茄和辣椒中e IF4E及eIF（iso）4E基因
• 3.1.1 核酸数据库上番茄eIF4E基因的搜集
• 3.1.2 核酸数据库上番茄eIF（iso）4E基因的搜集
• 3.1.3 核酸数据库上辣椒eIF4E基因的搜集
• 3.1.4 核酸数据库上辣椒eIF（iso）4E基因的搜集
• 3.1.5 研究基因的核苷酸序列的同源性比对结果
• 3.2 番茄和辣椒总RNA的提取及反转录
• 3.3 基因数字表达分析
• 3.4 番茄真核翻译起始因子4E基因在不同组织的表达分析
• 3.4.1 番茄eIF4E基因在不同组织的表达分析
• 3.4.2 番茄eIF（iso）4E基因的表达分析
• 3.5 番茄e IF4E基因cDNA的克隆及分析
• 3.5.1 番茄e IF4E基因cDNA的克隆
• 3.5.2 番茄eIF4E基因cDNA的序列分析
• 3.5.3 番茄e IF4E蛋白质的二级结构分析
• 3.6 辣椒e IF4E基因cDNA的克隆及分析
• 3.6.1 辣椒e IF4E基因cDNA的克隆
• 3.6.2 辣椒e IF4E基因cDNA序列分析
• 3.6.3 辣椒e IF4E蛋白质的二级结构分析
• 3.7 番茄eIF（iso）4E基因cDNA的克隆及分析
• 3.7.1 番茄eIF（iso）4E基因cDNA的克隆
• 3.7.2 番茄eIF（iso）4E基因cDNA分析
• 3.7.3 番茄eIF（iso）4E蛋白质的二级结构分析
• 3.8 辣椒eIF（iso）4E基因cDNA的克隆及分析
• 3.8.1 辣椒eIF（iso）4E基因cDNA的克隆
• 3.8.2 辣椒eIF（iso）4E基因cDNA分析
• 3.8.3 辣椒eIF（iso）4E蛋白质的二级结构分析
• 3.9 高等植物eIF4E/eIF（iso）4E氨基酸序列同源性比较及多序列比对
• 3.10 系统进化分析
• 3.11 正义和反义表达载体的构建
• 3.12 转基因植株的获得
• 3.13 转基因番茄植株的分子分析
• 3.14 转基因植株的生长发育的初步观察
• 4.讨论
• 4.1 生物信息学在基因功能研究中的应用
• 4.2 数字表达分析在基因表达分析中的可靠性
• 4.3 真核翻译其始因子4E作为新的抗病基因资源
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一:植物DNA的小量法提取程序
• 附录二:TriZOL一步法提取植物总RNA方法