前炎症细胞因子诱导的小鼠胶质细胞激活和Bcl-2表达以及与年龄的关系

论文摘要

目的：1．探讨小鼠脑实质，尤其是神经胶质细胞对于两种前炎症细胞因子丙种干扰素和肿瘤坏死因子（IFN-γ和TNF-α）的混合物诱导的急性神经炎症反应以及这种反应是否随着年龄的改变而变化；2．探讨前炎症细胞因子对神经元存活的影响；3．探讨神经元和神经胶质细胞在对抗炎症反应时二者的相互关系。方法：将不同年龄的动物C57BL／6J小鼠，分成三个组：2.3-3.5个月作为青年组，10-11个月作为中年组，19-22个月作为老年组。依赖立体定位技术，于小鼠右侧侧脑室内注射两种前炎症细胞因子的混合物（IFN-γ2μl+TNF-α2μl，生物活性均为500单位／每微升）4μl。PBS作为实验对照组。动物分别存活1、2和4天。使用GFAP免疫组织化学法检测小鼠脑实质星形胶质细胞GFAP的表达变化；用F4／80和CD11b两种小胶质细胞表面抗原的免疫组织化学法检测小胶质细胞F4／80和CD11b的表达变化；用抗凋亡蛋白Bcl-2的免疫组织化学法检测神经胶质细胞和神经元的Bcl-2的表达变化，并采用Western blot技术对其进行定量分析。Fluoro Jade B染色和Tunel染色，检测在前炎症细胞因子的作用下，神经元是否有凋亡或者坏死；免疫荧光双重标记技术，观察神经胶质细胞与Bcl-2阳性神经元之间的相互关系。结果：GFAP阳性的星形胶质细胞分布在梨状皮质和内嗅皮质、隔、整个海马结构、纹状体、杏仁核、皮质下白质及主要的纤维束。PBS注射的对照组动物，脑室周围的脑实质内GFAP阳性的星形胶质细胞展示出静息的形态特征：胞体小，分支细长，染色淡。细胞因子处理2天后，三个年龄组动物脑实质内GFAP阳性的星形胶质细胞明显被激活，表现出肥大的形态特征：细胞胞体相对增大，突起肥大，尤其在海马内明显。持续到注射后4天。与青年和中年组比较，老龄动物脑星形胶质细胞的这种变化尤为明显。定量分析表明，细胞因子处理2天后，老年组与中、青年组相比，海马CA1区、纹状体内GFAP阳性的星形胶质细胞数目和光密度比较，差异有显著性（P＜0.001）。PBS注射24小时后，三个年龄组小鼠脑室周围的脑实质内F4／80阳性的小胶质细胞展示出静息的形态特征：胞体较小，突起细长。细胞因子处理24小时后，与对照组比较，脑室周围的脑实质内有大量的F4／80阳性的小胶质细胞被激活，展示出肥大的（胞体增大，突起短粗）、阿米巴样或者杆形细胞等不同激活状态下的形态特征。激活的小胶质细胞主要分布于脑室周围的脑实质结构：海马、隔、纹状体、大脑皮质、脑室周围的丘脑结构和前丘脑，同时深入脑实质的深面。与青年和中年组动物比较，F4／80阳性小胶质细胞的激活在老龄动物脑中增强；老龄动物脑实质内有较多的阿米巴样小胶质细胞，CD11b的免疫组化结果与F4／80的相似。定量分析表明，细胞因子处理24小时后，在每个年龄组内，对于脑实质内小胶质细胞数目和密度进行Post-hoc检测，差异有显著性（P＜0.0001）；与青年和中年组动物比较，老龄动物脑实质内F4／80、CD11b阳性的小胶质细胞数目增加最为明显，染色密度最高，差异有显著性（P＜0.001）。FJB染色未发现FJB染色阳性的神经元；TUNEL染色未发现TUNEL染色阳性的神经元。Bcl-2阳性神经元在实验组和实验对照组均有所见，它们主要分布在第一、二运动皮质第ⅴ层和躯体感觉皮质、隔、斜角带核、海马和中脑红核等结构。Bcl-2免疫反应产物位于胞质及突起内，呈棕色，胞核不显色。Bcl-2阳性神经元在PBS注射后2天，与青年、中年组动物比较，老龄动物脑皮质、海马内Bcl-2表达明显上调（P＜0.01）。细胞因子注射2天后，与对照组比较，各年龄组动物皮质、海马内Bcl-2表达均有上调，表现为胞质及突起内Bcl-2免疫反应产物着色加深。这一变化可持续到注射后4天。与青年、中年组动物比较，老龄动物脑皮质内Bcl-2阳性细胞数目和光密度增加最为明显，定量分析结果表明其差异均有显著性（P＜0.01）。海马内Bcl-2的表达半定量结果与皮质的相似。此外，在皮质、海马和胼胝体内可见激活的星形胶质细胞表达抗凋亡蛋白Bcl-2；GFAP和Bcl-2免疫荧光双标记显示：Bcl-2免疫荧光阳性神经元周围被GFAP阳性星形胶质细胞的突起包绕或接触。实验对照组和细胞因子处理组动物皮质、海马内均有Bcl-2表达。Bcl-2为一分子量约为25-26KDa的单一蛋白带。定量的分析表明，PBS注射4天后，老年组与青年组和中年组比较，皮质和海马内Bcl-2蛋白质的表达均明显增加，差异有显著性（P＜0.01）；细胞因子注射4天后，中年组与青年组、老年组与青年组及老年组与中年组比较，皮质和海马内Bcl-2蛋白质的表达均明显增加，差异有显著性（P＜0.01）。结论：大脑脑室内注射联合细胞因子IFN-γ和TNF-α的混合物4μl，能够诱导脑实质急性神经炎症的发生。细胞因子注射后24小时，小胶质细胞明显被激活，F4／80和CD11b的表达上调；2天后，星形胶质细胞明显被激活，GFAP的表达上调；小胶质细胞的活化早于星形胶质细胞；神经胶质细胞的激活在老龄动物脑中最为明显。表明激活的神经胶质细胞可能参与脑内的免疫调节，老龄动物脑的神经胶质细胞对于炎症刺激的易感性增强。此剂量的联合细胞因子诱导的小鼠急性神经炎症反应，脑内没有发现已经死亡和正在经历死亡的神经元。细胞因子诱导的小鼠脑实质急性神经炎症反应，三个年龄组动物皮质、海马内抗凋亡蛋白Bcl-2表达均有上调，提示神经元内上调的Bcl-2可能参与脑内的免疫调节和保护性反应；Bcl-2的表达在老龄动物脑中强于中、青年组，提示老龄动物脑的神经元对于炎症刺激的易感性增强。激活的星形胶质细胞表达Bcl-2，可能参与其自身保护，Bcl-2阳性神经元周围被星形胶质细胞的突起包绕或接触，提示神经元和星形胶质细胞在参与脑内的免疫调节和保护性反应中关系密切。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词
• 正文
• 前言
• 第一部分 前炎症细胞因子诱导的小鼠脑内急性神经炎症动物模型的建立
• 1.1 材料和方法
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 细胞因子诱导的小鼠脑的神经胶质细胞的激活与年龄的关系
• 2.1 材料和方法
• 2.2 实验结果
• 2.3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 前炎症细胞因子对神经元活性的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果