海底热液口甲壳类线粒体基因组及罗氏沼虾生物钟基因的分子解析与进化分析

论文摘要

本研究成功测定和分析了两种海底热液口甲壳类的线粒体基因组。动物线粒体基因组通常包含37个基因,常用于系统进化和基因组演变研究。迄今已有1000多种动物线粒体全基因组被测定,然而,由于取样的困难至今尚未涉及热液口物种。柯氏绒铠虾（Shinkaia crosnieri）的线粒体基因组全长15182bp,与其他物种相比,缺失了4个tRNA基因,这种缺失很有可能通过胞质tRNA输入来补偿。S.crosnieri线粒体基因组拥有一个327bp的非编码控制区,是迄今十足目中最小的。与以罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）为代表的泛甲壳类（甲壳类+六足类）原始排列顺序相比,S.crosnieri基因组至少发生了6次重排,最终显示一个全新的基因顺序。系统进化分析证实S.crosnieri与长腕寄居蟹Pagurus longicaryus具有最近的亲缘关系。深海汤花蟹（Austinograeayunohana）的线粒体基因组是一个长15567bp的环状分子,其基因排列顺序与其他4种短尾下目物种相同。A.yunohana的控制区与澳大利亚巨蟹Pseudocarcinus gigas最为相似,系统进化分析确认了这一亲缘关系。研究表明相近的物种其线粒体基因组往往具有相同的基因排列顺序。无论是S.crosnieri还是A.yunohana,其线粒体基因组在遗传内容上与非热液口物种并没有本质上的差异,这就为热液口生物起源的“灭绝/重生假说”提供了重要的证据。另一方面,CLOCK属于bHLH/PAS转录因子蛋白超家族,是动物分子生物钟系统中的重要组分。目前,哺乳类、昆虫类、鸟类、鱼类以及两栖类的Clock基因都已分离得到。本研究分离了罗氏沼虾（Macrobrachium roscnbergii）的Clock基因（命名为Mar-Clock）,这个全长2115bp的cDNA编码一个704aa的蛋白（命名为Mar-CLOCK）。Mar-CLOCK与其他物种的CLOCK高度相似（30-35%）。这是甲壳类中报道的首个生物钟基因。Mar-CLOCK在其C末端有一个特别长（140aa）的谷氨酰胺富含区,可能与其转录活化能力有关。Mar-Clock在所有组织中都有表达。半定量RT-PCR的结果显示Mar-Clock在光暗周期中恒量表达。研究发现,摘除眼柄或常暗条件都能使Mar-Clock在中央神经系统中的表达增加。这些结果对处于常暗环境和眼柄退化的海底热液口甲壳类的生物钟研究提供了十分重要的基础。

论文目录

• 致谢
• 前言
• 摘要
• Abstract
• 插图和附表清单
• 缩略词和术语表
• 目次
• 1 绪论
• 1.1 分子系统进化分析
• 1.1.1 系统进化研究历史
• 1.1.2 氨基酸及核苷酸序列的比对
• 1.1.3 系统发育树的构建
• 1.2 动物线粒体基因组
• 1.2.1 线粒体研究历史
• 1.2.2 动物线粒体基因组分子结构
• 1.2.3 线粒体基因组研究现状
• 1.3 海底热液口甲壳类动物
• 1.3.1 海底热液口概况
• 1.3.2 海底热液口甲壳类
• 1.4 分子生物钟机理
• 1.4.1 果蝇的分子生物钟
• 1.4.2 脊椎动物的分子生物钟
• 1.4.3 甲壳动物亚门生物钟研究现状
• 2 柯氏绒铠虾（Shinkaia crosnieri）线粒体全基因组解析
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要软件
• 2.3 方法
• 2.3.1 基因组DNA提取
• 2.3.2 部分线粒体基因片段的扩增
• 2.3.3 线粒体全基因组的获得
• 2.3.4 长段基因间序列确定
• 2.3.5 基因组注释及序列分析
• 2.3.6 密码子使用和核苷酸组成
• 2.3.7 基因重排分析
• 2.3.8 系统进化分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 柯氏绒铠虾线粒体基因组的分子结构
• 2.4.2 蛋白编码基因和rRNA基因
• 2.4.3 tRNA基因
• 2.4.4 核苷酸组成和密码子使用
• 2.4.5 十足目及泛甲壳类线粒体基因组基因顺序
• 2.4.6 系统进化分析
• 3 深海汤花蟹（Austinograea yunohana）线粒体全基因组解析
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 主要软件
• 3.3 方法
• 3.3.1 基因组DNA提取
• 3.3.2 部分线粒体基因片段的扩增
• 3.3.3 线粒体全基因组的获得
• 3.3.4 基因组注释及序列分析
• 3.3.5 密码子使用和核苷酸组成
• 3.3.6 系统进化分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 深海汤花蟹线粒体基因组的分子结构
• 3.4.2 蛋白编码基因和rRNA基因
• 3.4.3 tRNA基因
• 3.4.4 核苷酸组成和密码子使用
• 3.4.5 系统进化分析
• 4 罗氏沼虾Clock基因（Mar-Clock）的分子解析及表达分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 主要软件
• 4.3 方法
• 4.3.1 总RNA提取及单链cDNA合成
• 4.3.2 Mar-Clock部分基因片段的获得
• 4.3.3 全长cDNA的获得
• 4.3.4 RT-PCR组织表达分析
• 4.3.5 半定量RT-PCR分析
• 4.3.6 序列比较与进化分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 Ear-Clock基因的分子结构
• 4.4.2 Ear-Clock在不同组织间的表达
• 4.4.3 摘除眼柄（EA）、常光（LL）及常暗（DD）对Mar-Clock表达的影响
• 4.4.4 由Mar-CLOCK反映的进化关系
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 有待开展的工作
• 参考文献
• 主要创新点
• 附录1 柯氏绒铠虾（Shinkaia crosnieri）线粒体基因组全序列
• 附录2 深海汤花蟹（Austinograea yunohana）线粒体基因组全序列
• 附录3 常用试剂配制
• 作者简历