南方水稻黑条矮缩病的监测及其病原病毒Pns6与寄主水稻的互作

论文摘要

水稻（Oryza sativa）是我国的主要粮食作物，病毒病一直是影响我国粮食稳定生产的一个重要问题。近十年来，多种水稻病毒病相继爆发流行，给水稻生产造成了巨大的经济损失，其中由一种新的植物呼肠孤病毒---南方水稻黑条矮缩病毒（Southern Rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑条矮缩病尤为重要。国内外学者对这种新病毒的生物学和分子生物学进行了许多研究，明确了南方水稻黑条矮缩病的地理分布、症状、病原性质、传播途径、品种抗性等生物学特性，并解析了病毒的基因组结构和少数编码蛋白的功能，但是对于病毒在寄主组织的分布和动态变化、多数编码蛋白的功能、病毒的致病机制、寄主抗感病作用机制等仍不清楚。因此，保持对水稻病毒病的监测，了解病毒在寄主体内的分布和动态变化，以及研究病毒与寄主间的互作关系，对于病毒病的防控以及阐明病毒的致病机制等方面具有重要的意义。首先，于2009-2012年间，在湖北、福建、江西、湖南、海南等省进行了水稻病毒病田间流行调查，并承担了这些省份水稻病毒病的诊断和检测任务，在此基础上，分析了水稻病毒病的种类、分布和流行特点。结果如下：首次报道了南方水稻黑条矮缩病毒在湖北水稻和玉米上的发生，以及验证了水稻条纹病毒在湖北水稻产区的存在；福建水稻病毒的种类较多，有SRBSDV、RBSDV（Rice blackstreaked dwarf virus）、RSV（Rice stripe virus）、RRSV（Rice ragged stunt virus）、RDV（Rice dwarf virus）、RGSV（Rice grassy stunt virus），国内流行的水稻病毒病在福建均有分布；湖南和江西两省是近几年我国水稻病毒病发生的重灾区，病原以SRBSDV为主，RRSV次之；海南省是我国南方水稻黑条矮缩病和水稻锯齿叶矮缩病的重要初侵染来源地。其次，测定了SRBSDV湖北分离物的全基因组序列，并以此序列为基础扩增了病毒13个基因的全长，在本氏烟细胞中分别表达这些基因，观察所表达蛋白的亚细胞定位。结果显示：SRBSDV湖北分离物全长29122bp，基因组核酸S10-S1的登录号分别为HM585270-HM585879；P1、P4、Pns52、P91这4个蛋白主要定位于细胞质，在细胞质中形成聚集体，Pns52、Pns91能形成较大颗粒状聚集体，而P1、P4则形成点状的聚集体；P2、P8、P3、P10这4个蛋白的定位相似，即可定位于细胞核，也可以定位于细胞质，在细胞质中都能够形成一些点状聚集体；P51、Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整个细胞，定位于细胞质中或膜上，沿细胞骨架等组分形成丝网状结构，Pns6和P51在细胞质中还能够形成颗粒状的聚集体。再次，通过电镜观察、RT-PCR和实时定量PCR技术研究了病毒在水稻组织中的分布和动态变化以及种子各组分的带毒情况。结果显示：SRBSDV只存在于韧皮部细胞中，是一个韧皮部组织限制的病毒；不同生育期的病株种子各组分都可以带毒，成熟种子虽可以携带SRBSDV，但是不能够经过种子传播；在水稻幼苗接种病毒后的30天内，根组织的病毒含量一直大于地上部分组织，病毒含量在12天或14天内增长比较缓慢，26d左右时可达到比较明显的水平；幼苗期根组织内的病毒含量远大于地上部分的叶片和叶鞘，而分蘖期根、叶、叶鞘、茎中的病毒含量差别不大，至扬花灌浆期后茎中的病毒含量远大于其它部位，进一步说明病毒在不同生育期、不同组织中的含量是不同的。最后，以SRBSDV Pns6为诱饵，利用酵母双杂交系统筛选水稻cDNA文库，钓取了24个可能与之互作的水稻蛋白；从中选取8个蛋白，经过RT-PCR获得了其完整阅读框，并将它们重组到酵母载体和BiFC植物表达载体上，通过酵母菌回复互作验证和BiFC体系的荧光互补验证，8个水稻蛋白中有5个能够与Pns6互作，这5个水稻蛋白是40S ribosomal protein S9-2、ubiquitin-conjugating enzyme、AP2domain containing protein、zinc finger protein、eukaryotic translation elongationfactor1A。在此基础上，进一步研究了OseEF1A（eukaryotic translation elongationfactor1A from Oryza sativa）与SRBSDV Pns6互作的意义以及OseEF1A与水稻病毒互作的普遍性，取得了如下结果：（1）SRBSDV Pns6除了与水稻eEF1A互作外，还与自身的基质蛋白Pns91互作，共定位实验表明Pns6可能招募Pns91和OseEF1A形成复合体，从而在病毒基因组复制和增殖中起某种作用；（2）RRSV的Pns10和Pns6都能够与OseEF1A在酵母中互作以及在本氏烟细胞中共定位，说明和SRBSDV一样，RRSV能够利用OseEF1A为病毒基因组复制和增殖服务；（3）除上述两种病毒外，OseEF1A还能够与RGDV的Pns11，RSV的NS3，RGSV的NS1、NS3和PC3等病毒蛋白在酵母中互作，并且还能够与作为DNA病毒的双生病毒相关蛋白在酵母中互作，从而证明了植物病毒利用eEF1A的普遍性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 南方水稻黑条矮缩病毒的研究进展
• 1.1.1 病害症状及流行概况
• 1.1.2 粒体形态和分类地位
• 1.1.3 基因组结构和功能
• 1.1.4 寄主植物和传毒介体
• 1.1.5 介体的传毒机制
• 1.1.6 SRBSDV 与寄主的互作研究
• 1.1.7 其它几种流行的水稻病毒病概述
• 1.2 本研究中用到的关键技术体系
• 1.2.1 酵母双杂交技术
• 1.2.2 双分子荧光互补技术
• 1.2.3 实时定量 PCR 技术
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 南方水稻黑条矮缩病的流行调查和检测
• 提要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒 dsRNA 基因组的提取和应用
• 2.2 2009-2012 年湖北省水稻病毒病的监测
• 2.3 2009-2012 年福建省水稻病毒病的监测
• 2.4 其它省份水稻病毒病检测
• 3 小结与讨论
• 3 SRBSDV 湖北分离物的测定及病毒基因的亚细胞定位
• 提要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 SRBSDV 湖北分离物的序列测定
• 2.2 SRBSDV 湖北分离物的序列分析
• 2.3 病毒基因植物表达载体 pEarleyGate101 的构建
• 2.4 病毒基因在本氏烟细胞中的定位
• 3 小结与讨论
• 4 SRBSDV 在寄主水稻体内的动态变化
• 提要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 样品总 RNA 的质量检测
• 2.2 实时定量引物扩增效率检测
• 2.3 SRBSDV 在感病水稻不同生育期各组织的动态变化
• 2.4 水稻幼苗接种 SRBSDV 后 30 天内的病毒动态变化
• 2.5 SRBSDV 在水稻组织内的分布
• 2.6 水稻种子带毒情况分析
• 3 小结与讨论
• 5 利用酵母双杂交系统筛选水稻 cDNA 文库
• 提要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 文库质量的检测
• 2.2 文库筛选初步结果
• 2.3 文库质粒插入片段的 PCR 鉴定
• 2.4 文库质粒插入片段的测定及同源性分析
• 3 小结与讨论
• 6 SRBSDV Pns6 与水稻蛋白互作的进一步验证
• 提要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 材料
• 2 结果与分析
• 2.1 互作蛋白全长基因的克隆
• 2.2 互作蛋白全长基因酵母表达载体的构建
• 2.3 互作蛋白全长与 Pns6 的酵母互作
• 2.4 互作蛋白全长 BiFC 表达载体的构建
• 2.5 双分子荧光互补验证 Pns6 与水稻蛋白的互作
• 2.6 互作水稻蛋白的表达量检测
• 3 小结与讨论
• 7 OseEF1A 与 SRBSDV Pns6 等病毒基因的互作研究
• 提要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 OseEF1A 与 SRBSDV 非结构蛋白的酵母互作
• 2.2 SRBSDV Pns6 与病毒非结构蛋白的酵母互作
• 2.3 OseEF1A 与 Pns6、Pns91 的共定位分析
• 2.4 OseEF1A 与其它水稻 dsRNA 病毒非结构蛋白的互作
• 2.5 OseEF1A 与 Tenuivirus 病毒蛋白的酵母互作
• 2.6 eEF1A 与 2 种双生病毒蛋白的酵母互作
• 3 小结与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢