中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因功能研究

论文摘要

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNVY10）为双生病毒科菜豆金色花叶病毒属成员,已发现其在番茄和烟草等作物上造成严重危害。TYLCCNV Y10的基因组为单链环状DNA分子,大小约为2.7 kb,共编码六个蛋白,其中一个348 bp ORF编码AV2蛋白,本论文研究发现该蛋白是RNA沉默抑制子。用pET-32a原核表达载体在大肠杆菌中表达了TYLCCNV Y10 AV2蛋白,以Ni2+-NTA亲和柱纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备了TYLCCNV Y10 AV2蛋白的多克隆抗体。含有AV2和GFP基因的植物表达载体经农杆菌共浸润GFP 16c本氏烟叶片,浸润后6天（6 dpi）在紫外下观察发现浸润区有明显绿色荧光,且浸润区周围有红晕,说明AV2具有抑制GFP 16c本氏烟GFP基因局部沉默的功能,但其不能抑制细胞到细胞的短距离沉默信号的传导。而且,在共浸润后30天时紫外下观察发现,GFP 16c本氏烟的系统叶仍发绿色荧光,说明AV2具有抑制GFP 16c本氏烟GFP基因系统沉默的功能。进一步用农杆菌浸润实验发现AV2能抑制GFP 16c本氏烟GFP基因系统沉默信号的传导。上述研究结果表明TYLCCNV Y10 AV2蛋白是RNA沉默抑制子。通过农杆菌浸润本氏烟进行AV2瞬时表达,在浸润48小时后在共聚焦显微镜下观察发现,AV2蛋白分布在细胞质中,并聚集成不规则的细胞质小体。将AV2构建到PVX的表达载体pGR106上,经农杆菌浸润本氏烟后5天会引起叶片的黄脉,后期引起退绿、皱缩、坏死斑、坏死等症状,表明在PVX异源表达系统中AV2蛋白是致病因子。进一步Northern blot分析发现5dpi和7 dpi浸润pGR106-AV2的本氏烟叶片PVX的含量均比浸润空质粒对照pGR106的叶片高。推断可能是因为AV2抑制了植物抗病毒的RNA沉默,使得PVX在本氏烟内大量繁殖。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 双生病毒分类及基因组结构研究进展
• 1 双生病毒的分类及基因组结构
• 1.1 玉米线条病毒属
• 1.2 甜菜曲顶病毒属
• 1.3 番茄伪曲顶病毒属
• 1.4 菜豆金色花叶病毒属
• 第二节 病毒编码的RNA沉默抑制子研究进展
• 1 RNA沉默简介
• 2 病毒编码的RNA沉默抑制子
• 3 RNA沉默抑制子的鉴定方法
• 3.1 农杆菌共浸润法
• 3.2 RNA沉默逆转法
• 3.3 稳定表达法和嫁接法
• 4 病毒编码的RNA沉默抑制的分子作用机理
• 4.1 HC-Pro的分子作用机理
• 4.2 CMV 2b的分子作用机理
• 4.3 P19的分子作用机理
• 5 双生病毒编码的RNA沉默抑制子
• 6 病毒编码的RNA沉默抑制子的应用
• 第二章 中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因的原核表达及多克隆抗体制备
• 1 材料与方法
• 1.1 质粒载体及菌株
• 1.2 酶及生化试剂
• 1.3 TYLCCNV Y10AV2基因的克隆
• 1.4 TYLCCNV Y10 AV2基因原核表达质粒的构建
• 1.5 TYLCCNV Y10 AV2基因的诱导表达、纯化及融合蛋白的鉴定
• 1.6 SDS-PAGE和Western blot
• 1.7 重组蛋白的多抗血清的制备
• 2 结果与分析
• 2.1 TYLCCNV Y10 AV2基因的克隆及序列分析
• 2.2 TYLCCNV Y10 AV2基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化
• 2.3 抗血清的效价
• 3 讨论
• 第三章 中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料、质粒载体、菌株及抗体
• 1.2 载体构建
• 1.3 农杆菌共浸润接种
• 1.4 GFP荧光观察和拍照
• 1.5 植物可溶性总蛋白样品的制备
• 1.6 SDS-PAGE和Western blot
• 1.7 RNA大量提取和Northern blot分析
• 1.8 沉默抑制子抑制信号传导的浸润方法
• 1.9 AV2蛋白的亚细胞定位
• 2 结果与分析
• 2.1 TYLCCNV编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c转基因本氏烟的局部沉默
• 2.2 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c转基因本氏烟的GFP基因系统沉默
• 2.3 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白能抑制GFP 16c本氏烟的GFP基因系统沉默信号的传导
• 2.4 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白不能抑制GFP 16c转基因本氏烟中短距离沉默信号的传导
• 2.5 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位
• 2.6 TYLCCNV Y10编码的AV2蛋白在PVX异源表达系统中是症状决定因子
• 3 讨论
• 附 齿兰环斑病毒多克隆抗体制备及应用
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒、质粒载体及菌株
• 1.2 酶及生化试剂
• 1.3 ORSV外壳蛋白基因（CP）的克隆
• 1.4 ORSV CP基因原核表达载体的构建
• 1.5 ORSV CP基因的诱导表达、纯化及融合蛋白的鉴定
• 1.6 重组蛋白的多抗血清的制备
• 1.7 Dot-blot ELISA检测方法的建立及检测应用
• 1.8 免疫捕获反转录PCR（IC-RT-PCR）的建立及检测应用
• 2 结果与分析
• 2.1 ORSV CP基因的克隆及序列分析
• 2.2 ORSV CP基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达、纯化
• 2.3 抗血清的效价和特异性
• 2.4 Dot-blot ELISA的建立及检测ORSV应用
• 2.5 检测ORSV的IC-RT-PCR方法的建立及应用
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录A:本论文所用病毒缩写及中英文对照
• 附录B 本论文中所用术语缩写与中英文对照
• 附录C 常用缓冲液及培养基配方
• 附录D 常用生化及分子生物学试剂与仪器
• 作者简历