猪Myostatin启动子上游调控序列的鉴定

论文摘要

肌肉生长抑制素（Myostatin）基因是生长转化因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）超家族中的一员，是动物肌肉生长发育过程中一个重要的负调控主效基因。Myostatin基因的编码区在不同物种间相对保守，其编码的蛋白前体由三部分组成：N末端信号肽、N端前导肽和C末端成熟肽。但由于其C末端氨基酸序列与TGF-β家族其他成员的同源性较低（最高45%），因而又可归为新的GDF-8（Growth-differentiationfactor8）家族成员之一。1.猪Myostatin基因启动子上游调控区潜在结合位点的研究在本研究中，首先，利用PCR的方法扩增得到猪Myostatin基因上游最长为1969bp的启动子片段。将不同长度的启动子片段连接绿色荧光报告基因载体后，转染C2C12成肌细胞和NIH3T3成纤维细胞，结果仅在成肌细胞中出现绿色荧光现象，说明Myostatin基因启动子为组织特异性启动子。其次，对该启动子区域采用逐步删除的方法获得5个新的长度不等的启动子片段，利用荧光素酶报告基因实验检测其在C2C12成肌细胞中的活性。实验结果显示，在Myostatin基因启动子转录起始位点上游1bp至-137bp，-137bp至-466bp内存在有两个转录正调控区域，而在-852bp至-1969bp内存在有一个转录负调控区域。再次，对于转录活性上调效果明显的-137bp至-466bp区域，我们进一步细分后最终确定转录正调控作用的顺式作用元件位点位于-137bp至-218bp区域内。最后，根据已有文献报道及序列特征，设计并合成4条生物素标记的双链DNA探针，通过电泳凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility ShiftAssay，EMSA）验证，-206bp至-189bp区域能够与转录因子蛋白结合，并通过特异位点冷探针竞争实验、-206bp至-189bp区域碱基突变实验、-206bp至-189bp区域特异缺失载体的荧光素酶活性检测实验，最终确定该区域为转录因子蛋白的特异结合位点。2.转录因子结合蛋白的分析鉴定首先，根据生物软件预测和文献报道的转录因子结合位点分析，推测该区域为转录因子蛋白MEF2家族成员结合位点。其次，构建真核表达质粒载体pC-MEF2A、pC-MEF2C，以C2C12成肌细胞和诱导的肌管细胞为研究对象，转入含有MEF2结合位点的启动子片段和上述真核表达载体，通过荧光素酶活性检测实验和浓度梯度实验，发现高表达转录因子MEF2C后能够显著增强Myostatin基因启动子活性26倍，而高表达另一亚型MEF2A，启动子活性无明显改变，初步证明结合的转录因子蛋白为MEF2C。再次，利用EMSASupershift实验，确定与Myostatin基因启动子上游结合的正调控转录因子蛋白为MEF2C。最后，设计并合成內源MEF2C干扰片段，以C2C12成肌细胞和诱导的肌管细胞为研究对象，分别转入MEF2C真核表达载体及其干扰片段，用实时定量PCR和Western blotting方法检测Myostatin基因转录及蛋白水平的变化，结果发现MEF2C过表达时，Myostatin基因的mRNA转录水平升高了24倍，蛋白表达水平也明显升高；当內源MEF2C被干扰沉默后，Myostatin基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显降低。这些结果显示，MEF2C可以通过激活Myostatin基因，从而在猪肌肉生长发育过程发挥关键性的调节作用。本研究为Myostatin基因的转录调控提供了确切有效的顺式元件作用位点和与之结合的转录因子蛋白，为更加深入的探讨Myostatin的功能和调控网络提供了一种新的研究方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 Myostatin 基因的调控作用
• 1.1 Myostatin 基因的结构与生物学功能
• 1.2 Myostatin 基因的分子调控机制
• 1.2.1 Myostatin 基因对肌肉生长的调控
• 1.2.2 Myostatin 基因对胚胎发育的影响
• 1.3 Myostatin 基因与相关疾病研究
• 1.3.1 肌营养不良症的治疗
• 1.3.2 代谢紊乱动物模型
• 1.3.3 未来的研究方向
• 1.4 小结
• 第二章 Myostatin 相关信号通路及其启动子的研究
• 2.1 TGF-β超家族信号通路研究
• 2.2 MEF2 家族、MyoD、Smad 家族等信号传导相关研究
• 2.2.1 MEF2（Myocyte-specific enhancer factor）等调控因子相关信号通路
• 2.2.2 Smad 家族相关信号通路
• 2.2.3 其它某些因子或激酶等对信号传导的影响
• 2.3 Myostatin 启动子相关研究
• 2.4 小结
• 试验研究
• 第三章 猪 Myostatin 基因启动子上游调控区潜在结合位点的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 构建不同长度调控序列载体检测启动子活性
• 3.2.2 EMSA 检测潜在结合位点与转录因子蛋白的结合
• 3.2.3 冷探针竞争反应、突变反应检测结合特异性
• 3.2.4 特异位点缺失检测启动子活性变化
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 转录因子结合蛋白的分析鉴定
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 生物信息学软件预测转录因子结合蛋白
• 4.2.2 过表达转录因子结合蛋白检测启动子活性
• 4.2.3 RNA 干扰转录因子结合蛋白检测启动子活性
• 4.2.4 实时定量 PCR、Western 和 Supershift 检测 mRNA 和蛋白水平变化
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介