论文摘要
第一章：5-氮唑-2’-脱氧胞苷（5-Aza-dc）对ACC-2、ACC-3和ACC-M细胞株RUNX3表达的影响腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是涎腺中最为常见的恶性肿瘤之一，约占所有涎腺上皮性肿瘤的10％，其临床特点是生长缓慢，但侵袭性较强，易侵犯神经及血管，远处转移率高达40％。然而目前对该肿瘤的高侵袭性和远处转移的具体机制仍缺乏了解。人类Runt相关转录因子-3（human runt-related transcriptionfactor-3，RUNX3）是在胃癌中新发现的抑癌基因，由该基因甲基化引起的表达减少或缺失与胃癌的高侵袭性和远处转移密切相关，而在一些肿瘤细胞株中这种甲基化状态可以被DNA甲基化的逆转录酶5-氮唑-2’-脱氧胞苷（5-Aza-dc）在体外环境中逆转。基于RUNX3基因与肿瘤转移的相关性，因而对RUNX3基因及蛋白在涎腺腺样囊性癌细胞株中的表达情况作一探讨。实验一分别用RT-PCR、免疫荧光化学和Western blot检测ACC-2、ACC-3和ACC-M细胞在5-Aza-dc处理前后的RUNX3的表达无菌条件下取腺样囊性癌ACC-2和ACC-3细胞株以及肺高转移性腺样囊性癌ACC-M细胞株，将培养瓶置于二氧化碳孵箱中培养，培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。倒置相差显微镜下观察细胞活力，传代培养后加入300nmol／L 5-Aza-dc共培养72hrs后，分别提取总RNA和蛋白质，检测RUNX3 mRNA和蛋白质的表达。Western blot结果用Image-Pro Plus软件进行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值进行标准校正，计算RUNX3蛋白产物的相对量。实验结果：RT-PCR结果显示RUNX3 mRNA在ACC-2和ACC-3细胞株中存在弱表达，而在ACC-M中无表达。经过300nmol／L 5-Aza-dc处理后，RUNX3的表达在以上三株细胞株中的表达均提高。Western blot结果显示RUNX3蛋白分子量约为45kDa，通过灰度比值，RUNX3相对表达量在5-Aza-dc处理后比处理前有所增加，Western blot和RT-PCR的结果相似。激光共聚焦结果显示RUNX3蛋白主要定位在细胞浆中，经过300nmol／L 5-Aza-dc处理72hrs后，在ACC-2和ACC-3细胞核中出现表达，而在ACC-M细胞中仍然定位在细胞浆中。这部分实验结果初步说明RUNX3基因甲基化可能是腺样囊性癌细胞株中RUNX3表达抑制的一个相关因素，而RUNX3在肺高转移性腺样囊性癌细胞株ACC-M中的表达缺失可能与该肿瘤的远处转移有关。由于RUNX3蛋白在细胞核内表达时才能激活相应的靶基因发挥作用，RUNX3蛋白在腺样囊性癌细胞株中的细胞浆中异位表达，可能与RUNX3蛋白的功能被抑制有关，其具体机制有待于进一步阐明。第二章：涎腺腺样囊性癌中RUNX3基因启动子CpG岛甲基化的关键位点和演进规律一些研究表明，RUNX3基因启动子CpG岛高甲基化是该基因表达沉默的主要方式之一。前一章结果表明腺样囊性癌细胞株ACC-2、ACC-3和ACC-M细胞株在DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dc共培养后RUNX3表达有所增加，提示在该肿瘤中RUNX3基因存在甲基化。RUNX3基因作为一个新的抑癌基因，在多种恶性肿瘤中由于启动子甲基化而导致表达抑制甚至缺失。但腺样囊性癌中RUNX3基因沉默的机制目前尚未阐明。因此在本章中对人涎腺腺样囊性癌及相应的正常涎腺组织标本中RUNX3基因启动子CpG岛多位点的甲基化状态与RUNX3基因甲基化和临床病理指标之间的相互关系作一比较分析，对腺样囊性癌中RUNX3基因甲基化的关键位点和演进规律作初步探讨，以更好地了解其分子机制。实验二以定量甲基化特异性PCR（qMSP）法检测41例涎腺腺样囊性癌及其相应的正常涎腺组织中RUNX3基因的甲基化状态以及RUNX3基因启动子CpG岛第1-10位点中各位点的甲基化状态，用Logistic ANOVA模型分析RUNX3基因及各位点甲基化在涎腺腺样囊性癌中发生的危险度，并比较RUNX3基因启动子甲基化与腺样囊性癌临床病理因素之间的相关性。同时用Western blot法检测19例经过qMSP检测的腺样囊性癌及其匹配的正常涎腺组织中RUNX3蛋白的表达，以分析RUNX3基因启动子甲基化对蛋白表达的影响。实验结果：实时定量qMSP结果显示腺样囊性癌及其相应正常涎腺组织中其RUNX3基因甲基化阳性率分别为42．69％-85．69％和22．17％-59．43％。RUNX3基因在第1、2位点（5’区）甲基化程度最高，随着向转录起始点方向演进，甲基化程度逐渐减弱，在转录起始点位置（第7-8位点）甲基化阳性率最低，向3’方向甲基化又略微升高。另外，在正常涎腺组织中RUNX3基因各位点甲基化定量值显著低于腺样囊性癌（P＜0．001），同时在转录起始点位置甲基化阳性率最低。Logistic ANOVA模型分析结果进一步说明RUNX3基因启动子CpG岛的甲基化是人涎腺腺样囊性癌发生的一个重要因素，RUNX3基因CpG岛的甲基化从5’区向转录起始点方向演进，转录起始点区可能是RUNX3基因甲基化的关键位点。Western blot结果显示腺样囊性癌中RUNX3蛋白的表达量显著低于匹配的正常涎腺组织中的表达（P＜0．001），而腺样囊性癌中RUNX3基因启动子CpG岛的甲基化阳性率显著高于正常涎腺标本（P＜0．001），在一定程度上说明RUNX3基因甲基化是引起RUNX3蛋白表达下调的原因之一，也与肿瘤的发生相关。虽然RUNX3基因CpG岛各位点甲基化程度与各临床病理因素之间未发现有显著相关性，检测RUNX3基因转录起始点区域的甲基化状态在肿瘤的诊断和风险评估中仍有参考价值。基因甲基化是引起肿瘤发生一个重要因素，本实验中人涎腺腺样囊性癌RUNX3基因启动子CpG岛甲基化的发生率显著高于正常涎腺组织，并且是导致RUNX3蛋白表达下调的原因之一，说明RUNX3基因甲基化与腺样囊性癌的发生存在密切联系。通过定量qMSP法检测各位点的甲基化状态说明各位点的甲基化程度存在差异，其甲基化现象是从5’区向转录起始点不断演进，而启动子区转录起始点可能是RUNX3基因甲基化的关键位点，在检测RUNX3基因甲基化状态时，应选择转录起始点周围的区域进行检测，如本实验中的第6-8位点。另外，本实验中未发现RUNX3基因的甲基化与肿瘤临床病理因素之间的相关性，这可能需要增加临床样本进行进一步评估。第三章：RUNX3在涎腺腺样囊性癌和正常涎腺中的表达及与患者预后的相关性涎腺腺样囊性癌患者的远期预后较差。目前的一些研究认为外科切缘阳性、临床分期、病理类型、神经侵犯等是腺样囊性癌患者的一个预后因素。同时，在分子水平一些研究者认为一些增殖或凋亡相关基因与腺样囊性癌患者的预后相关。RUNX3作为在胃癌中新发现的一种抑癌基因，其表达的沉默与胃癌的发生和发展及远处转移有着高度的相关性，而且也影响着胃癌的治疗效果和预后，因此检测恶性肿瘤中RUNX3的表达可能提供一个比较好的预后指标。由于腺样囊性癌患者出现远处转移是导致其预后差的一个主要因素，虽然在涎腺腺样囊性癌中没有关于RUNX3表达的报道，基于RUNX3与肿瘤远处转移的相关性，探讨RUNX3在ACC中的表达对判断该肿瘤的发生进展和预后都将有一个参考作用。塞验三分别用荧光定量qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测RUNX3在正常涎腺和腺样囊性癌中的表达从液氮中取出9例正常涎腺（包括3例腮腺、2例舌下腺及2例颌下腺）和7例腺样囊性癌组织，分别以荧光定量RT-PCR和Western blot检测RUNX3 mRNA和蛋白的表达情况。qRT-PCR结果以标准曲线法测定RUNX3 mRNA的相对表达量。Western blot结果用Image-Pro Plus软件进行灰度分析，以GAPDH蛋白的灰度值进行标准校正，计算RUNX3蛋白产物的相对量。同时用免疫组织化学检测73例石蜡包埋的腺样囊性癌组织中RUNX3蛋白在肿瘤细胞中的定位表达情况。实验结果：荧光定量qRT-PCR结果显示，与正常涎腺组织中RUNX3 mRNA的表达量（0．19±0．08）相比，RUNX3 mRNA在腺样囊性癌中的表达水平（0．09±0．05）下调了2．2倍。Western blot结果显示在人正常涎腺和腺样囊性癌中均存在分子量约为45kDa的RUNX3蛋白的表达。通过灰度值显示：腺样囊性癌组织中RUNX3蛋白的相对表达量（0．79±0．03）低于正常涎腺组织中的相对表达量（0．88±0．03）。免疫组化显示在正常涎腺组织中，RUNX3蛋白主要表达在腺泡细胞和导管细胞的细胞浆和细胞核中；在腺样囊性癌中则均表达在细胞浆中，在一些实体型ACC中则无表达。实验四分析RUNX3表达与腺样囊性癌临床病理指标和预后的相关性以Image-Pro Plus图像分析软件检测RUNX3蛋白在73例腺样囊性癌中的表达水平，并以Tertile法将其分为高表达组（≥14．91％）、中表达组（6．94％-14．91％）和低表达组（≤6．94％），并分析RUNX3的表达水平与73例腺样囊性癌的临床病理指标的相关性。同时以Cox回归模型评价各临床病理指标与预后的相关性，以Kaplan-Meier生存曲线检测RUNX3表达水平对患者预后的影响，从而评估RUNX3在涎腺腺样囊性癌中的表达对评价患者的预后的临床价值。实验结果：免疫组化半定量结果显示RUNX3高、中和低表达组中RUNX3的阳性表达率分别为19．60±4,26％、11．19±2．42％和4．78±1．59％。而筛孔型、导管型和实性型腺样囊性癌中RUNX3的表达率分别为：13．69±6．46％、11．78±4．40％和8．864±5．20％，RUNX3低表达与腺样囊性癌的组织病理类型（实性型）密切相关（P=0．025），同时RUNX3低表达的腺样囊性癌具有高度的远处转移可能（P=0．009），这些结果提示RUNX3的表达抑制与肿瘤的分化及进展存在密切联系。在T1-3期腺样囊性癌中RUNX3的表达率为13．65±6．44％，在T4期中其表达率为10．24±5．19％。统计学结果显示RUNX3低表达与肿瘤临床分期存在弱相关（P=0．061）。RUNX3的低表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、神经浸润和淋巴转移无统计学差异。预后分析显示18例RUNX3高表达、37例RUNX3中表达及18例RUNX3低表达腺样囊性癌患者的5年生存率分别为90％、75．4％和48．27％。单因素Cox回归模型分析显示RUNX3低表达（P=0．012），淋巴结转移（P=0．007），远处转移（P＜0．001）与患者预后显著相关。Kaplan-Meier生存曲线结果显示RUNX3高表达组的生存率显著高于RUNX3低表达组（P=0．022）。同时临床分期（T4期）（P=0．003），淋巴转移（P=0．004）和远处转移（P＜0．001）与患者的预后显著相关。然而腺样囊性癌的病理类型（实体型）（P=0．771）和神经浸润（P=0．554）与患者的预后无统计学差异。而多因素Cox回归模型显示只有远处转移是患者预后的独立指标（P=0．043），而T4分期与患者的预后存在弱相关（P=0．063）。目前的研究认为RUNX3作为一个抑癌基因，其表达水平与患者预后和生存期显著相关，可能是影响恶性肿瘤预后的独立指标。RUNX3高表达的恶性肿瘤中，其5年生存率显著高于RUNX3低表达者，并且与细胞分化程度有关，高分化的恶性肿瘤中RUNX3表达水平高于低分化者，且RUNX3低表达与肿瘤的远处转移能力显著相关。本实验的结果表明RUNX3蛋白的表达可能与人涎腺腺样囊性癌的病理分化和转移相关，提示RUNX3蛋白的表达下调可能对ACC的发生发展具有重要作用，检测该肿瘤中RUNX3蛋白的表达情况可能有助于腺样囊性癌的筛查、临床诊断和预后判断。结论：1．RUNX3在腺样囊性癌细胞株ACC-2和ACC-3中存在表达，而在肺高转移腺样囊性癌细胞株ACC-M中则无表达。经过300nmol／L的5-Aza-dc处理72小时后能提高RUNX3在这些细胞株中的表达。2．人涎腺腺样囊性癌中RUNX3基因甲基化的概率显著高于正常涎腺组织，提示RUNX3基因启动子CpG岛甲基化是人涎腺腺样囊性癌发生的一个重要因素。3．RUNX3基因CpG岛的甲基化的规律是从5’区向转录起始点方向演进，转录起始点的甲基化程度最低，提示该位点为RUNX3基因甲基化的关键位点。4．RUNX3基因CpG岛的甲基化状态与肿瘤临床病理指标之间无显著相关性。5．RUNX3在人涎腺腺样囊性癌中存在表达。RUNX3蛋白低表达与肿瘤的分化和远处转移及患者的预后存在显著关系，对临床预后的判断具有诊断价值。