莱茵衣藻ACP1和RCA2基因在油脂积累中的功能分析

论文摘要

生物柴油属于可再生能源,是优质的石油柴油代用品。许多微藻具备大量生产中性脂（三酰甘油）的能力,是很好的生物柴油来源,但目前人类对于多数微藻的生长方式、代谢途径等相关的研究并不多。从成本的角度考虑,适合大规模培养的优质藻种还未筛选到,培养技术还不成熟,因此利用微藻生产生物柴油至今尚未实现商业化。有文献报道ACP1（酰基载体蛋白）和RCA2（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶）两个基因在植物中分别与油脂代谢和光合作用相关,但在莱茵衣藻中尚无相关报道。莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻,其基因组测序已全部完成,并成功实现了细胞核、叶绿体、线粒体基因组的遗传转化,是很好的模式物种,对我们深入了解微藻油脂代谢的调控机理有着重要的借鉴意义。本研究在本实验室已有的基础上,选择莱茵衣藻的ACP1和RCA2基因为研究对象,以细胞壁缺失、精氨酸依赖型莱茵衣藻为实验材料,首先通过一步法PCR构建2种针对ACP1和RCA2基因的amiRNA供体载体,通过接合转移技术（MAGIC）分别构建针对这2种基因的amiRNA表达载体,然后将这2种干扰表达载体分别转入莱茵衣藻细胞。实时荧光定量PCR的结果表明,amiRNA-ACP1和amiRNA-RCA2表达量高,ACP1和RCA2沉默效果显著。荧光分光光度法法测定相对脂含量变化的结果表明,两种基因的沉默均对莱茵衣藻油脂含量的积累产生影响,其中ACP1的影响尤为显著,表明其与莱茵衣藻油脂积累途径密切相关,有很大的发掘空间,为探寻通过分子生物途径提高微藻油脂产量的方法提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.1 莱茵衣藻的研究概况
• 1.1.1 莱茵衣藻的概述
• 1.1.1.1 莱茵衣藻的分类地位及其细胞结构
• 1.1.1.2 莱茵衣藻的生活史
• 1.1.1.3 莱茵衣藻是一种很好的模式生物
• 1.1.2 莱茵衣藻的遗传转化研究进展
• 1.1.2.1 莱茵衣藻的遗传学特性
• 1.1.2.2 遗传转化方法概述
• 1.1.3 莱茵衣藻三套基因组转化研究概况
• 1.1.3.1 莱茵衣藻的核基因组转化
• 1.1.3.2 莱茵衣藻的叶绿体转化
• 1.1.3.3 莱茵衣藻的线粒体转化
• 1.2 微藻的油脂合成与积累概况
• 1.2.1 植物油脂的生物合成与积累
• 1.2.1.1 三酰甘油的生物合成与积累
• 1.2.1.2 油脂合成中的重要酶类
• 1.2.2 微藻油脂的合成与积累
• 1.2.2.1 微藻油脂概述
• 1.2.2.2 三酰甘油的生物合成与积累
• 1.2.3 微藻与高等植物脂代谢的比较
• 1.2.4 微藻油脂积累的影响因素
• 1.2.4.1 营养物
• 1.2.4.2 温度
• 1.2.4.3 光照强度
• 1.2.4.4 生长期及生理状态
• 1.3 基因功能研究方法概况
• 1.3.1 基因转导技术
• 1.3.2 反义技术
• 1.3.3 基因敲除与敲入
• 1.3.4 RNA干扰技术
• 1.3.4.1 MicroRNA的形成及作用机制
• 1.3.4.2 siRNA与miRNA的比较
• 1.3.4.3 植物miRNA的生物学功能
• 1.4 酰基载体蛋白（ACP）的研究现状
• 1.4.1 编码ACP的基因家族
• 1.4.1.1 植物ACP基因家族
• 1.4.1.2 植物ACP基因结构与染色体分布
• 1.4.2 有关ACP1基因功能的研究
• 1.5 Rubisco活化酶（RCA）的研究现状
• 1.5.1 RCA的发现
• 1.5.2 RCA的分子特性与功能
• 1.5.3 RCA活化Rubisco的作用机制
• 1.6 生物柴油的研究概况
• 1.6.1 生物柴油概况
• 1.6.2 微藻产油的发展现状
• 1.6.2.1 微藻产油的广阔前景
• 1.6.2.2 面临的问题
• 1.7 本文的研究目的和意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 供试质粒
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 酶、试剂和材料
• 2.1.6 仪器和设备
• 2.1.7 主要缓冲液和抗生素的配制
• 2.1.8 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 普通PCR扩增
• 2.2.2 DNA胶回收
• 2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（TB法）
• 2.2.4 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.5 大肠杆菌的快速转化
• 2.2.6 质粒DNA的抽提及纯化（碱裂解法）
• 2.2.7 细菌接合转移实验
• 2.2.8 莱茵衣藻的培养
• 2.2.9 莱茵衣藻的遗传转化（玻璃珠震荡法）
• 2.2.10 衣藻总DNA的提取
• 2.2.11 衣藻总RNA的提取（Trizol试剂法）
• 2.2.12 cDNA第一条链的反转录合成
• 2.2.13 相对荧光实时定量PCR
• 2.2.14 光密度分析莱茵衣藻的生长状况
• 2.2.15 尼罗红染色荧光分光光度法快速检测莱茵衣藻中性脂相对含量
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 ACP1和RCA2干扰靶的设计
• 3.2 miRNA表达载体的构建
• 3.2.1 miRNA供体载体的构建
• 3.2.1.1 供体载体pRTK-acp1的构建
• 3.2.1.2 供体载体pRTK-rca2的构建
• 3.2.2 miRNA受体表达载体的构建
• 3.2.2.1 受体载体pmiR1162-acp1的构建
• 3.2.2.2 受体载体pmiR1162-rca2的构建
• 3.3 转基因藻株的获得
• 3.3.1 莱茵衣藻的遗传转化结果
• 3.3.1.1 表达载体pmiR1162-acp1在莱茵衣藻中的遗传转化
• 3.3.1.2 表达载体pmiRl162-rca2在莱茵衣藻中的遗传转化
• 3.3.2 莱茵衣藻转化子的鉴定
• 3.3.2.1 amiR-ACP1转化子的鉴定
• 3.3.2.2 amiR-RCA2转化子的鉴定
• 3.4 转基因藻株的干扰效果分析
• 3.4.1 荧光实时定量PCR的引物设计
• 3.4.2 干扰效果分析
• 3.5 生长状态分析
• 3.6 细胞内油脂含量变化的分析
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.1.1 MicroRNA在莱茵衣藻中的干扰效果
• 4.1.2 ACP1基因下调的影响
• 4.1.3 RCA2基因下调的影响
• 4.2 展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢