菲牛蛭抗凝活性蛋白的提取和纯化工艺研究

论文摘要

心脑血管疾病严重危害人类的健康,《中国心血管病报告2010》中的数据显示,我国每年约有300万人死于心血管疾病,占全部死亡原因的40%左右,居各种死因之首。相关资料显示：这类疾病的发生是非正常的凝血过程所导致,与血管壁、血小管、抗凝、纤溶及血液流变等密切相关。本实验以广东菲牛蛭为研究对象,对其中的抗凝活性蛋白进行了提取纯化,使用了超滤技术和冷冻干燥技术进行浓缩,同时结合DEAE阴离子柱和ODS反相柱进行分离,初步分离出4种蛋白,利用基质辅助激光解析—飞行时问二级质谱（MALDI-TOF-MS/MS）进行测定,并简单建立专属数据库。在提取工艺方面,以抗凝活性回收率为指标,考察不同沉淀方法对菲牛蛭体内抗凝活性成分的影响,从而确定了乙醇沉淀工艺,并采用单因素考察法优选提取工艺。最终优选结果为：在匀浆上清液中滴加冷乙醇至终浓度20%,去除部分杂蛋白,离心后上清液继续滴加冷乙醇至终浓度80%,离心,获得菲牛蛭活性粗提物。经测定,所含抗凝活性单位为在纯化工艺方面,以抗凝活性回收率和蛋白纯度为指标,考察不同层析介质对目的蛋白的吸附性差异,最终确立了阴离子柱层析和ODS反相层析两种方法。经考察,DEAE阴离子层析的最佳分离条件为：0.02mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液,不同浓度的氯化钠溶液作为洗脱缓冲液,紫外254nm在线监测,同时测定抗凝活性；ODS反相层析的最佳分离条件为：20%乙醇-水-三氟乙酸（含0.03%NaH2PO4）作为平衡体系,30%乙醇-水-三氟乙酸（含0.03%NaH2PO4）作为洗脱体系,254nm在线检测,同时测定抗凝活性。结果获得4个蛋白多肽,电泳纯,其中一个为主要抗凝活性多肽,经SDS-聚丙烯凝胶电泳测定分子量为19.2KDa。在含量测定方面,采用凝血酶滴定法测定其生物活性,二喹啉甲酸法测定其蛋白含量,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白及MALDI-TOF-MS/MS进行蛋白鉴定,结果显示：所得蛋白多肽含单位抗凝血酶活性单位不低于2742ATU/mg,对NCBI数据库进行搜索没有发现相似结构的物质。研究结果表明,利用乙醇沉淀、阴离子交换柱层析和反相层析对菲牛蛭抗凝活性物质进行分离纯化,工艺设计合理、稳定可行。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 引言
• 第一章 文献研究
• 1.1 水蛭药材的研究进展
• 1.1.1 水蛭品种
• 1.1.2 水蛭化学成分的研究概况
• 1.2 凝血、抗凝及血栓机理
• 1.2.1 凝血、抗凝与纤溶系统
• 1.2.2 心血管疾病的形成及治疗
• 1.3 水蛭抗凝机理研究进展
• 1.3.1 水蛭素类抗凝物质的结构研究
• 1.3.2 水蛭素类抗凝物质的机理研究
• 1.4 水蛭抗凝物质的评价指标
• 1.4.1 凝血酶滴定法
• 1.4.2 生物底色法（Chromogenic Substrate Assay,CSA）
• 1.4.3 BAEE法
• 1.4.4 光散射法
• 1.4.5 纤维蛋白原平板测定法
• 1.4.6 凝血酶时间测定法
• 1.4.7 ECT法
• 1.4.8 RP-HPLC
• 1.5 水蛭有效抗凝物质的分离纯化进展
• 1.5.1 蛋白多肽的纯化技术
• 1.5.2 水蛭有效抗凝物质的分离纯化进展
• 1.6 课题研究意义
• 1.7 研究设计思路
• 第二章 菲牛蛭抗凝活性物质的粗提工艺
• 2.1 仪器与材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 材料与试剂
• 2.2 方法与结果
• 2.2.1 预处理
• 2.2.2 菲牛蛭体内抗凝活性物质的稳定性考察
• 2.2.3 醇沉工艺研究
• 2.2.4 活性粗提物的提取工艺研究
• 2.2.5 菲牛蛭冷冻鲜体的粗提工艺的重复性考察
• 2.2.6 聚丙烯凝胶电泳分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 匀浆缓冲液的选择
• 2.3.2 沉淀方法的选择
• 2.3.3 醇沉工艺的影响因素
• 2.3.4 凝血酶滴定法的影响因素
• 2.3.5 PAGE
• 2.3.6 纯化
• 2.4 小结
• 第三章 菲牛蛭抗凝活性物质的中间纯化工艺
• 3.1 仪器与材料
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 材料与试剂
• 3.2 方法与结果
• 3.2.1 静态试验
• 3.2.2 动态试验
• 3.2.3 聚丙烯电泳凝胶电泳分析
• 3.2.4 浓缩、除盐及保存
• 3.2.5 菲牛蛭抗凝组分的比活计算
• 3.2.6 离子柱纯化工艺的重复性考察
• 3.3 讨论
• 3.3.1 平衡缓冲液的pH值
• 3.3.2 洗脱剂
• 3.3.3 除盐与浓缩
• 3.3.4 层析柱的再生
• 3.4 小结
• 第四章 菲牛蛭抗凝活性物质的精制纯化
• 4.1 仪器与材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 材料与试剂
• 4.2 方法与结果
• 4.2.1 RPC分离条件的建立
• 4.2.2 浓缩和保存
• 4.2.3 纯度分析
• 4.2.4 菲牛蛭抗凝活性多肽的比活计算
• 4.2.5 反相柱纯化工艺的重复性考察
• 4.2.6 菲牛蛭抗凝活性多肽分子量测定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 有机修饰剂
• 4.3.2 三氟乙酸
• 4.3.3 去除乙醇
• 4.3.4 浓缩方法
• 4.3.5 抗凝活性物质
• 4.3.6 SDS-PAGE与Native-PAGE区别
• 4.3.7 小分子多肽凝胶电泳——Tricine-SDS-PAGE
• 4.3.8 纯化
• 4.4 小结
• 第五章 质谱鉴定
• 5.1 仪器与材料
• 5.2 方法与结果
• 5.2.1 样品处理
• 5.2.2 样品酶解
• 5.2.3 数据库的建立
• 5.2.4 MALDI-TOF-MS鉴定
• 5.2.5 结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 Fa:血清白蛋白（Serum albumin）
• 5.3.2 Fd:热休克蛋白（Heat shock protein）
• 5.3.3 Fb和Fc
• 5.4 小结
• 结语
• 1. 研究工作总结
• 2. 后续研究工作
• 3. 创新点
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录一
• 1. 英文缩写
• 2. 菲牛蛭数据库
• 3. MALDI-TOF-MS/MS谱图
• 附录二
• 致谢