禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

禽戊型肝炎（HEV）是由禽戊型肝炎病毒（Avian Hepatitis E Virus）感染所致的病毒肝炎,主要经肠道传播,临床症状表现为为肝脾肿大,肝坏死,肝出血,卵巢退化,死亡率上升及产蛋率下降等。2001年,Haqshenas等从患有肝脾肿大（hepatitis-splenomegaly, HS）综合症的鸡胆汁中首次分离出禽HEV。自禽HEV发现以来,对禽HEV血清流行病学的调查已有了数篇的报道,但由于禽HEV和人、猪HEV ORF2抗体的交叉反应,使得血清学的调查一直处于初级阶段。禽HEV ORF2基因序列同人、猪HEV的同源性为48-49%,其中ORF2蛋白中最保守的区域位于aa339-606。将本实验室保存的禽HEV ORF2-1重组质粒转入大肠杆菌原核表达禽HEV ORF2-1蛋白（aa339-564）,经过提纯后免疫小鼠,经常规的细胞融合和亚克隆制备出6株禽HEV ORF2-1蛋白的单克隆抗体（7H12, 3E8, 1B5, 1H5, 3A1和6G8）。利用9段ORF2截短的蛋白（ORF2-19）和8个多肽,通过间接ELISA方法,确定6株单抗7H12, 3E8, 1B5, 1H5, 3A1和6G8分别识别aa339-355, aa355-384, aa355-384, aa384-414, aa389-398和aa510-516。3E8和1B5两株单抗识别同一抗原表位区aa355-383,但这一抗原表位区含有28aa,为了区别3E8和1B5,将3E8用HRP标记后做竞争ELISA,竞争ELISA结果显示3E8和1B5两株单抗识别两个不相互重叠的抗原表位。2009年,赵钦等从中国患有大肝大脾的鸡胆汁中首次分离出禽HEV,将中国株禽HEV攻毒SPF鸡,采集攻毒后粪便、血清等。利用6株单抗采用免疫捕获病毒方法去捕获攻毒后粪便中的禽HEV,其中7H12和1H5两株单抗可以捕获到病毒,进一步通过免疫组化实验证明7H12和1H5可以检测到攻毒鸡的器官中有禽HEV ORF2蛋白的存在。本实验制备出的6株单克隆抗体为研究禽、人和猪HEVs血清学调查提供了良好的物质基础。同时,7H12和1H5两株单抗可以捕获禽HEV病毒为禽HEV的确诊提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 戊型肝炎的概况
• 1.1.1 戊型肝炎病毒的病原学
• 1.1.2 戊型肝炎病毒的基因组结构
• 1.1.3 病毒的宿主范围与增殖
• 1.1.4 戊型肝炎的流行病学
• 1.1.5 检测方法
• 1.1.6 疫苗的研制
• 1.2 禽戊型肝炎病毒的研究进展
• 1.2.1 禽戊型肝炎病毒病原学
• 1.2.2 禽戊型肝炎病毒流行病学研究状况
• 1.2.3 禽戊型肝炎病毒免疫学研究状况
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 载体
• 2.1.3 实验动物及病毒株
• 2.1.4 工具酶和主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 溶液的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 禽 HEV ORF2-1 重组质粒的鉴定
• 2.2.2 禽 HEV ORF2-1 蛋白的表达与纯化
• 2.2.3 禽 HEV ORF2s 蛋白的设计、构建、表达、鉴定和纯化
• 2.2.4 小鼠的免疫
• 2.2.5 免疫小鼠抗体效价的测定
• 2.2.6 单克隆抗体的制备
• 2.2.7 单克隆抗体的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 禽HEV ORF2-1 重组质粒的鉴定
• 3.1.1 重组质粒禽HEV ORF2-1 的酶切鉴定
• 3.1.2 重组质粒禽HEV ORF2-1 基因测序
• 3.2 禽HEV ORF2-1 蛋白的表达与鉴定
• 3.2.1 禽HEV ORF2-1 蛋白的表达
• 3.2.2 禽HEV ORF2-1 蛋白的Western blot 鉴定
• 3.3 禽 HEV ORF2s 蛋白的设计
• 3.3.1 禽HEV ORF2-1 蛋白的分析
• 3.3.2 禽 HEV ORF2s 引物的设计
• 3.4 禽 HEV ORF2s 蛋白纯化和鉴定
• 3.4.1 禽 HEV ORF2s 蛋白的纯化
• 3.4.2 禽 HEV ORF2s 纯化蛋白的鉴定
• 3.5 免疫小鼠抗体效价检测
• 3.6 抗禽 HEV ORF 2-1 蛋白特异性单克隆抗体细胞的筛选
• 3.7 单抗腹水的制备与纯化
• 3.7.1 单抗腹水的效价测定
• 3.7.2 单抗腹水的纯化
• 3.8 单克隆抗体的鉴定
• 3.8.1 单抗的特异性鉴定
• 3.8.2 单抗亚型的鉴定
• 3.8.3 单克隆抗体的功能鉴定
• 4 讨论
• 4.1 禽 HEV ORF2s 的表达和纯化
• 4.2 单克隆抗体的制备与鉴定
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 致谢
• 8 攻读学位期间发表论文情况