论文摘要
第一部分新型选择复制性腺病毒M5以及M6的构建及鉴定【目的】构建及鉴定两种表达HSV-TK基因的新型选择复制性腺病毒【方法】采用PCR的方法扩增得到HSV-TK基因的全长,通过T4连接酶将TK全长连接到PcDNA3.1+/E3⊿6.7k/gp19k以及PcDNA3.1+/E3⊿ADP上,然后采用同源重组法构建M5以及M6。将得到的病毒感染293后提取HirtDNA,然后通过酶切以及PCR的方法鉴定M5以及M6。【结果】将通过PCR方法扩增得到的全长送到测序公司测序后证明其序列是正确的,将以HirtDNA作为模板PCR扩增后得到的产物进行凝胶电泳,在1.2kb处有目的条带存在,将用BanⅢ酶切过的HirtDNA凝胶电泳后在1.2kb左右以及30kb以上可见目的条带。【结论】成功的构建了表达HSV-TK基因的新型选择复制性腺病毒M5以及M6第二部分 两种新型选择复制性腺病毒M5以及M6同Adv-TK体外效应的对比【目的】比较选择复制性腺病毒M5以及M6与Adv-TK的体外效果【方法】Western blot检测M5,M6以及Adv-TK感染肿瘤细胞以及正常细胞后细胞中TK蛋白的表达量,结晶紫染色检测M5,M6以及Adv-TK对肿瘤细胞以及正常细胞的裂解作用,real-time PCR法检测M5,M6以及Adv-TK在肿瘤细胞以及正常细胞中的复制能力,MTT法以及流式细胞术检测并比较M5,M6以及Adv-TK对各种肿瘤细胞以及正常细胞的杀伤作用。【结果】在肿瘤细胞中,M5以及M6的TK蛋白表达量高于Adv-TK,其中M6的表达量在这三种病毒中最高,而在正常细胞中,Adv-TK的TK蛋白表达量要明显高于M5以及M6,而M6在正常细胞中几乎不表达TK蛋白；结晶紫染色显示Adv-TK对肿瘤细胞没有裂解作用,在腺病毒感染第三天,M5对肿瘤细胞的裂解效应要强于M6,但到感染第五天,M6对肿瘤细胞的裂解作用要强于M5,而即使以很高的MOI感染正常细胞,M5以及M6也不能裂解正常细胞；在腺病毒感染肿瘤细胞后36小时内,M5的复制量要大于M6,36h之后,M6的复制量要大于M5,Adv-TK在肿瘤细胞中不复制,而在正常细胞中,M5,M6以及Adv-TK均不复制；在以高浓度病毒感染肿瘤细胞时,M5,M6以及Adv-TK对肿瘤细胞的杀伤效应相似,但以低浓度病毒感染肿瘤细胞时,M5以及M6对肿瘤细胞的杀伤效应要明显强于Adv-TK,且M6的肿瘤杀伤效应也强于M5,而当M5,M6以及Adv-TK以500MOI感染正常细胞时,M6对正常细胞几乎无杀伤作用,而M5对正常细胞的杀伤作用也明显小于Adv-TK。【结论】在高MOI时,M5,M6以及Adv-TK对肿瘤细胞的杀伤效应相似；在低MOI时,M5以及M6对肿瘤细胞的杀伤能力要明显强于Adv-TK,且M6的肿瘤杀伤效应也强于M5,但M5以及M6对正常细胞的毒性明显小于Adv-TK。第三部分M5,M6以及Adv-TK对裸鼠原位瘤治疗效应的对比【目的】比较选择复制性腺病毒M5,M6与Adv-TK的体内效应【方法】构建裸鼠胃癌原位模型,将Ad5/dElA,M5和M6以及Adv-TK注入裸鼠体内,并连续14天注射更昔洛韦,每天60 mg/kg,比较M5,M6以及Adv-TK对原位胃癌肿瘤的治疗作用及对肿瘤转移的影响,并比较对小鼠生存率的影响,HE染色显示对比肿瘤局部的组织结构,原位杂交检测对比腺病毒在肿瘤局部的复制情况,免疫组化检测对比存在于肿瘤局部的腺病毒的量,Weastern blot法检测肿瘤局部TK蛋白的表达量。【结果】M5和M6以及Adv-TK均可抑制原位肿瘤的生长,但M5以及M6对原位肿瘤的生长抑制作用明显强于Adv-TK,而M6对原位肿瘤的生长抑制作用要强于M5；M5以及M6抑制肿瘤转移的能力也强于Adv-TK；相较于其他治疗组,M6组的局部肿瘤组织中可检测到更多病毒量以及病毒复制,M5组局部肿瘤组织检测到的病毒量也多于Adv-TK组；M5以及M6组中的TK蛋白表达量也高于Adv-TK组；M5以及M6组小鼠生存率明显高于Adv-TK组,且M6组小鼠生存率也高于M5组。【结论】M5以及M6对原位肿瘤的生长以及转移的抑制作用明显强于Adv-TK,且M5以及M6对小鼠生存率的提高也明显高于Adv-TK。第四部分M5,M6以及Adv-TK在免疫全能小鼠肿瘤模型中的治疗作用以及代谢情况的对比【目的】比较M5,M6以及Adv-TK对免疫全能小鼠皮下瘤的治疗作用,并对比这三种腺病毒在全能小鼠肿瘤模型中的代谢情况【方法】构建C57BL/6小鼠结肠癌皮下瘤模型,随机分为5组,分别注射PBS,Ad5/dE1A, M5, M6以及Adv-TK,并每组连续注射更昔洛韦14天,每天60ng/kg,观察各组病毒对小鼠皮下瘤的生长抑制作用,每组分别在病毒注射后1d,4d,7d,14d以及28d处死5只小鼠,real-time PCR法检测瘤体内腺病毒的量以及TK表达量【结果】M5和M6以及Adv-TK均可抑制免疫全能小鼠中皮下瘤的生长,但M5以及M6对肿瘤的生长抑制作用明显强于Adv-TK,且M6对肿瘤的生长抑制作用要强于M5；M5以及M6在肿瘤局部存在的时间比Adv-TK长,且病毒量在注射后第四天急剧减少,到注射后第7天,M5以及M6的病毒水平达到第二个高峰；M5以及M6组中肿瘤中TK的表达量高于Adv-TK组,且M5以及M6组TK表达的持续时间也较Adv-TK组长。【结论】M5以及M6在免疫全能小鼠中对肿瘤的治疗作用强于Adv-TK,其原因与M5以及M6中肿瘤局部的病毒量以及TK表达量要高于Adv-TK组有关。第五部分M5以及M6体内应用的安全性研究【目的】探讨M5以及M6在体内应用的安全性问题【方法】分别将PBS,Ad5/dE1A,M5,M6以及Adv-TK注射入小鼠体内,取眼动脉血进行肝肾功能检测,HE染色检测各脏器病理反应,real-time PCR法检测各组织腺病毒的表达情况,流式细胞术检测外周血以及脾脏中CD4+以及CD8+淋巴细胞的变化情况,TCID50法检测血清中抗腺病毒中和抗体。【结果】同PBS组相比,M5,M6以及Adv-TK仅引起一过性的肌酐的升高；小鼠的肝,脾,肾等也未见明显的病理改变；M5,M6以及Adv-TK被注射入体内后,在肝,脾,肾中均有表达,其中在肝中表达的时间较长,且三种病毒之间的表达无明显差异；外周血中的CD4+以及CD8+淋巴细胞在病毒注射后无明显变化,而脾中的CD4’以及CD8+淋巴细胞均出现一过性的减少,且M5,M6以及Adv-TK引起的变化趋势以及程度相似；M5,M6以及Adv-TK在小鼠中引起的中和抗体的数量以及变化趋势无明显差异。【结论】M5以及M6在体内应用具有较好的安全性
论文目录
相关论文文献
- [1].重组腺病毒ADV-TK对肝癌抑制作用的实验研究[J]. 华西医学 2010(11)
- [2].重组腺病毒ADV-TK基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用[J]. 南方医科大学学报 2010(08)
- [3].ADV-tk重组腺病毒的构建及检测[J]. 中国普外基础与临床杂志 2010(07)
标签：选择复制性腺病毒论文; 同源重组论文; 酶切论文; 裂解效应论文; 复制能力论文; 杀伤效应论文; 胃癌原位模型论文; 治疗论文; 肿瘤转移论文; 生存率论文; 小鼠论文; 腺病毒论文; 皮下瘤论文; 安全性论文; 中和抗体论文; 淋巴细胞论文;