人工肺表面活性物质作为胰岛素肺部给药载体的研究

论文摘要

本文旨在探讨人工肺表面活性物质（APS）作为蛋白多肽类药物肺部给药载体，利用APS与天然肺表面活性物质相似的性质，在提高蛋白多肽类药物肺部给药生物利用度的同时，减轻给药对肺部造成的损伤。采用二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）为主要成分，筛选制备四种APS，作为胰岛素肺部给药的载体。研究比较了不同APS降低最低表面张力的能力，以及加入胰岛素前后对APS最低表面张力的影响，研究比较了胰岛素—人工肺表面活性物质（INS-APS）系统肺部给药后大鼠体内药效学和药动学的变化，考察了INS-APS系统连续给药后对肺损伤的保护作用，并研究了肺Ⅱ型上皮细胞对INS-APS系统的吸收和转运，以及INS-APS系统的稳定性。1．APS和INS-APS处方和制备工艺研究采用薄膜超声分散法和直接超声分散法制备多种处方APS，采用实验室自制的脉冲气泡表面张力仪测定气液界面最低表面张力，以降低气液界面最低表面张力为指标筛选出四种不同的APS处方，对实验中制备的APS降低表面张力机理进行初步探讨，并考察胰岛素对APS降低最低表面张力的影响。实验显示：四利，处方的APS（DT、DPG、DHT和DLP）可使气液界而最低表面张力降至1.32、1.88、4.02、9.50mN／m，接近天然肺表面活性物质。胰岛素的加入对APS的表面张力没有显著影响（P＞0.05）。四种INS-APS系统和APS的最低表面张力顺序一致，依次为：IDT＜IDPG＜IDHT＜IDLP。APS降低表面张力的机理可能与其改变DPPC相变温度和相变热有关。2．INS-APS系统正常大鼠肺部给药的药效学考察气管滴注给药后，INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT和IDLP）的最低血糖水平分别为19％、26％、24％和37％，前三者显著低于普通INS溶液的36％（P＜0.05）。IDLP的最低血糖水平和血糖经时曲线上面积（AAC）与普通INS溶液相似，没有显著性差异（P＞0.05）。INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT和IDLP）给药后能在较长时间内维持血糖处于较低水平，持效时间（＜80％）分别为5.5、5.5、5.5、5.2h，显著长于普通INS溶液的3.9h（P＜0.05）。说明APS作为载体不仅能够增强胰岛素的降血糖作用，而且能延长胰岛素的持效时间。四种INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT和IDLP）的药理相对生物利用度（f％）分别为40％、36％、38％、29％，高于普通INS溶液的27％。不同INS-APS系统肺部给药后AAC和药理相对生物利用度有显著性差异（P＜0.05），说明不同APS促进胰岛素降低血糖的程度不同。INS-APS系统药理相对生物利用度与其最低表面张力呈负相关，相关系数达到-0.9688，表明实验情况下APS的最低表面张力与其增强胰岛素降低血糖的作用相关性良好。3．INS-APS系统正常大鼠肺部给药的药动学考察气管滴注给药后，四种INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT和IDLP）肺部给药后的最高血清胰岛素分别为172μIU／mL、16μIU／mL、131μIU／mL和93μIU／mL，显著高于普通INS溶液的64μIU／mL（P＜0.05）。INS-APS系统的胰岛素经时曲线下面积（AUC）显著大于普通INS溶液（P＜0.05）。INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT和IDLP）的相对生物利用度（F％）分别达到48％、40％、36％和32％，高于普通INS溶液气管滴注给药（27％）。说明APS作为载体可显著增强胰岛素的肺部吸收。不同INS-APS系统肺部给药后AUC和相对生物利用度有显著性差异（P＜0.05），说明不同APS促进胰岛素吸收的程度是不同的。INS-APS系统的相对生物利用度与其最低表面张力的相关系数达到-0.8145，表明在此情况下，APS的最低表面张力与其促进胰岛素肺部吸收有较好相关性。4．INS-APS系统肺部给药损伤性的体内外初步考察用酵母多糖刺激巨噬细胞吞噬异物产生的化学发光衡量INS-APS系统对肺损伤的影响，并对连续气管滴注给药后的肺组织病理学变化进行了考察。结果显示，IDHT和IDT能够抑制化学发光，对氧自由基引起的损伤有一定缓解作用，而IDPG和IDLP不能抑制氧自由基引起的化学发光，表明不同INS-APS系统对氧自由基造成的损伤缓解程度不同。病理学观察结果显示，四种INS-APS系统（IDT、IDPG、IDHT、IDLP）连续气管滴注给药后的肺水肿指数分别为4.89、4.84、5.04和5.06，显著低于普通INS溶液给药组的5.47（P＜0.05）。肺组织病理切片的改变情况也均明显轻于普通INS溶液，并接近正常组。说明APS作为胰岛素肺部给药载体可显著降低给药对肺的损伤程度，比普通INS溶液更适合于肺部给药。5．INS-APS系统体外细胞转运的初步研究采用Calu-3细胞单层模型初步研究四种APS对Calu-3细胞的毒性以及四种INS-APS系统经AP→BL方向的转运情况。MTT实验结果表明，4h内APS对Calu-3细胞单层没有明显的毒性。Calu-3细胞单层转运实验的初步结果表明，四种INS-APS系统与普通INS溶液4h的胰岛素累积转运浓度有显著性差异（P＜0.05），4h累积转运浓度顺序为IDT＞IDHT＞IDPG＞IDLP＞INS。初步实验结果发现INS溶液和INS-APS系统通过Calu-3细胞单层的转运方式可能并非单纯的被动扩散，具体机制有待进一步研究。。6．INS-APS系统稳定性考察对四种INS-APS系统受pH值、酶的影响进行研究，同时考察了INS-APS系统表面张力两个月的稳定性。在pH1.2的0.1mol／L的HCl和pH7.4的磷酸盐缓冲液中37℃孵育3h，INS溶液和INS-APS系统基本处于稳定状态（P＞0.05）。在蛋白酶降解作用下，INS-APS系统对胰岛素没有明显的保护作用。INS-APS系统最低表面张力在4℃和25℃条件下易发生变化，其稳定性还有待提高。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 INS-APS系统的制备
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 表面张力测定方法
• 2.1.1 原理
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 方法评价
• 2.2 APS各组分表面张力的测定
• 2.3 APS的制备和处方筛选
• 2.4 APS降低表面张力机理的探讨
• 2.5 INS-APS系统的制备
• 2.6 INS-APS系统的粒径测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 脉冲气泡表面张力仪测定表面张力的方法验证
• 3.2 各种表面活性物质的最低表面张力
• 3.3 不同处方APS的最低表面张力
• 3.4 各种APS表面张力变化
• 3.5 APS降低表面张力机理的探讨
• 3.6 胰岛素对APS最低表面张力的影响
• 3.7 INS-APS系统的粒径
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 INS-APS系统大鼠体内药效学研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 葡萄糖氧化酶法测定血糖
• 2.1.1 测定原理
• 2.1.2 测定方法
• 2.1.3 标准曲线的建立
• 2.1.4 葡萄糖在血清中的回收率试验
• 2.2 INS-APS系统肺部给药后大鼠体内药效学研究
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 给药方法
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.4 药效学评价方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果和讨论
• 3.1 葡萄糖氧化酶法测定血糖
• 3.1.1 标准曲线
• 3.1.2 葡萄糖在血清中的回收率实验
• 3.2 INS-APS系统肺部给药后大鼠体内药效学研究
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 INS-APS系统大鼠体内药动学研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 放射免疫法测定血清胰岛素含量
• 2.1.1 测定原理
• 2.1.2 测定方法
• 2.1.3 计算及处理方法
• 2.2 INS-APS系统肺部给药后大鼠体内药动学研究
• 2.2.1 动物实验
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 药动学评价方法
• 2.3 统计学处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 放射免疫法测定血清中胰岛素含量
• 3.2 INS-APS系统肺部给药后大鼠体内药动学研究
• 4 小结
• 参考文献
• 第四章 INS-APS系统大鼠肺部损伤性的初步考察
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品
• 1.2 仪器
• 1.3 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 化学发光
• 2.1.1 原理
• 2.1.2 细胞培养
• 2.1.3 巨噬细胞化学发光值的测定
• 2.1.4 相对化学发光指数的计算
• 2.2 肺损伤病理学观察
• 2.2.1 动物实验
• 2.2.2 全肺观察
• 2.2.3 肺水肿指数
• 2.2.4 石蜡包埋切片的制作
• 2.3 数据处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 相对化学发光指数
• 3.2 气管滴注给药后肺部情况变化
• 3.3 湿干肺重比
• 3.4 给药后大鼠肺部组织病理学观察
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 INS-APS系统Calu-3细胞转运的初步研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 胰岛素含量测定
• 2.1.1 色谱条件
• 2.1.2 空白溶剂对胰岛素测定的影响
• 2.1.3 标准曲线
• 2.1.4 胰岛素DPBS溶液稳定性
• 2.2 MTT试验
• 2.2.1 试验原理
• 2.2.2 方法
• 2.3 INS-APS系统通过Calu-3细胞转运
• 2.3.1 细胞培养
• 2.3.2 细胞形态观察
• 2.3.3 转运试验
• 3 结果与讨论
• 3.1 空白溶液对测定的影响
• 3.2 标准曲线
• 3.3 方法评价
• 3.4 胰岛素DPBS溶液稳定性
• 3.5 Calu-3细胞形态
• 3.6 MTT细胞毒性试验
• 3.7 INS-APS系统细胞转运试验
• 3.7.1 转运装置对胰岛素的吸附
• 3.7.2 INS-APS系统Calu-3细胞转运的初步试验
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 INS-APS系统稳定性考察
• 1 材料与仪器
• 1.1 药品与试剂
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 胰岛素含量测定
• 2.1.1 色谱条件
• 2.1.2 空白溶液对测定的影响
• 2.1.3 标准曲线的制备
• 2.1.4 回收率试验
• 2.1.5 精密度试验
• 2.2 pH对INS-APS系统中胰岛素稳定性的影响
• 2.3 蛋白酶对INS-APS系统中胰岛素稳定性的影响
• 2.4 INS-APS系统最低表面张力随时间的变化
• 3 结果与讨论
• 3.1 空白溶液对测定的影响
• 3.2 标准曲线
• 3.3 方法评价
• 3.3.1 pH1.2胰岛素溶液
• 3.3.2 pH7.4胰岛素溶液
• 3.4 pH对INS-APS系统中胰岛素稳定性的影响
• 3.5 INS-APS系统中APS对胰岛素抵抗蛋白酶降解的作用
• 3.6 INS-APS系统最低表面张力随时间的变化
• 4 小结
• 参考文献
• 总结和展望
• 总结
• 创新
• 展望
• 致谢
• 附录
• 综述