元基因组文库中食品工业酶基因的克隆表达

论文摘要

肉眼看不见或者看不清楚的一切生物被称为微生物,微生物与人类的生活密不可分,他们在工业应用中担任着很多重要的角色,足迹遍布于冶金、食品、制药、皮革与石油等领域。可是在微生物中可在实验室培养的微生物不到1%,这使得人们对不能培养的99%的微生物群这个巨大的资源产生了极大的兴趣,元基因组就是最近新兴的一种寻找资源的方式之一。元基因组文库指的是从环境中直接提取混合微生物的基因组的DNA,mRNA,克隆到宿主细胞中,构建得到的基因组文库或cDNA文库,从中可以发现有用的基因并能研究微生物的生理生化特点。本研究通过对实验室前期构建的热泉Bac文库中的得到的阳性克隆进行454（焦磷酸合成法）全基因组测序后,对拼接得到的酶基因序列进行克隆表达,并对湖南热泉的前期建库做了准备,得到的结果如下：1.对湖南周边热泉进行了土样采集,分别用试剂盒提取与液氮研磨的法提取的方法提取出了土壤的总DNA,用于构建基因文库。2.成功的从洱源热泉Bac库中克隆表达出了纤维素酶基因、木聚糖酶、蛋白酶、酯酶、淀粉酶、葡萄糖苷（脂）酰鞘氨醇酶以及β-1,3-葡聚糖酶基因,并对以上几种酶的粗酶液进行了初步的检测。在ncbi上比对了以上几种酶基因的蛋白序列,其中淀粉酶、葡萄糖苷（脂）酰鞘氨醇酶、木聚糖酶、蛋白酶与已知序列的相似性相比比较低,有可能成为新的工业酶基因。3.成功地通过HPLC镍柱纯化到了淀粉酶与β-1,3-葡聚糖酶,纯化得到的蛋白通过SDS-PAGE分析发现得到的蛋白纯度比较高,蛋白条带单一。4.对纯化得到的β-1,3-葡聚糖酶进行了酶学性质分析最适温度为60℃,在60℃以下的温度中放置2h后,葡聚糖酶酶活仍保持在90%以上；在70℃放置2h小时后酶活仍可保留60%左右,说明此酶在中高温条件下活性较高并且稳定性较好,为一新型的中高温葡聚糖酶。本研究中的葡聚糖酶在pH6-8的条件下酶活均在80%以上,最适反应pH为7.0,说明在中性条件下有较好的稳定性。另外,Ba2+、Ca2+对此酶的活性有一定的激活作用,而Cu2+与Zn2+对其有着抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 元基因组研究现状以及前景
• 1.1 元基因组的概念
• 1.2 元基因文库的构建
• 1.3 元基因组的研究进展
• 1.4 元基因组的前景
• 2 454测序技术
• 3 各种酶在食品工业中的应用
• 3.1 纤维素酶在食品中的应用
• 3.2 淀粉酶在食品工业中的应用
• 3.3 木聚糖酶在食品中的应用
• 3.4 β-葡聚糖酶在食品中的应用
• 3.5 蛋白酶在食品中的应用
• 3.6 酯酶在食品中的应用
• 本研究的目的与意义
• 第二章 湖南热泉建库以及洱源Bac文库阳性克隆测序分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 湖南热泉建库前期准备
• 1.2.2 洱源热泉样品454测序
• 1.2.3 BAC克隆质粒提取以及进一步测序
• 2 结果与分析
• 2.1 湖南热泉土壤DNA提取
• 2.2 郴州样品16SrRNA基因扩增结果
• 2.3 拼接序列数据分析
• 2.4 淀粉酶、甘露聚糖酶BAC克隆的进一步测序
• 3 结论
• 4 讨论
• 第三章 洱源文库中食品工业酶基因的克隆表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 筛库获得的阳性克隆进行基因组提取
• 1.2.2 设计引物
• 1.2.3 PCR的方法克隆纤维素酶基因与载体连接
• 1.2.4 凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收
• 1.2.5 目的片段与载体双酶切
• 1.2.6 酶切后的目的片段与载体连接
• 1.2.7 目的基因转至BL21进行表达以及测序鉴定
• 1.2.8 蛋白的诱导表达
• 1.2.9 SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达
• 1.2.10 淀粉酶的纯化
• 1.2.11 酶液酶学性质分析
• 2 结果
• 2.1 纤维素酶克隆表达以及初步鉴定
• 2.2 淀粉酶基因克隆表达及初步鉴定
• 2.3 木聚糖酶基因克隆表达以及初步鉴定
• 2.4 葡聚糖酶基因克隆表达以及粗酶性质结果
• PAGE分析'>2.5 葡萄糖苷（脂）酰鞘氨醇酶PCR扩增结果以及SDS_PAGE分析
• 2.6 蛋白酶基因克隆表达以及粗酶性质结果
• 2.7 酯酶基因克隆表达以及粗酶性质结果
• 2.8 淀粉酶纯化
• 3 结论
• 4 讨论
• 第四章 β-1,3-葡聚糖酶纯化以及酶学性质分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌体诱导培养,集菌
• 1.2.2 超声波破碎
• 1.2.3 HPLC纯化蛋白
• 1.2.4 最适温度
• 1.2.5 最适pH
• 1.2.6 热稳定性
• 1.2.7 金属离子对酶活的影响
• 1.2.8 底物特异性分析
• 1.2.9 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
• 1.2.10 动力学性质分析
• 2 结果分析
• 2.1 测序以及序列分析
• 2.2 葡聚糖酶的表达以及纯化
• 2.3 酶活及底物特异性测定
• 2.4 葡聚糖酶酶学性质
• 2.5 酶的动力学性质
• 3 结论
• 4 讨论
• 参考文献
• 本文主要结论
• 本文创新点与展望
• 致谢
• 作者简介