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一类新型双光子核酸荧光探针在固定及活细胞中显微成像性能的研究

2020-12-07阅读(897)

一类新型双光子核酸荧光探针在固定及活细胞中显微成像性能的研究

论文摘要

双光子激光共聚焦荧光显微镜（Two-photon laser scanning fluorescencemicroscopy,TPM）因其具有独特的优势而被广泛应用于生命科学及医学领域。然而由于缺乏真正意义的双光子荧光探针,使双光子荧光显微镜的应用受到了很大程度上的限制。利用双光子荧光显微镜,长时间高空间分辨地活体观测核酸的生命活动是非常有意义的工作,然而目前尚无同时满足优良双光子特性和活体染色要求的双光子核酸荧光探针被报道。本论文针对两种以咔唑荧光团为母体结构的双光子荧光探针BMVC和9E-BHVC开展工作。我们发现,在溶液中该咔唑系列荧光探针对环境变化具有敏感的响应能力:溶剂极性和局部微环境粘度的改变都能在很大程度上影响探针的荧光发射,此外探针在缓冲液中仅有微弱的荧光,但与DNA作用后荧光显著增强,据此我们推断该探针是能形成TICT态的一类0-1逻辑的分子光开关型探针。BMVC和9E-BHVC在DNA中有较高的量子效率（23.6%和38.9%）和大的活性吸收截面（45.08 GM和90.64 GM）,且对DNA具有高的亲和力(结合常数分别为5.2×106M（-1）和7.8×106M-1)。与BMVC相比,9E-BHVC表现出作为双光子荧光探针更好的特性,例如具有更大的活性吸收截面和更高的结合常数,且具有更好的水溶性（可达到mM级）。9E-BHVC这些优良的性质预示着该分子如果能够在复杂的细胞环境中特异性地识别DNA,那么它将是真正意义的双光子核成像探针。因此,本论文进一步对9E-BHVC的细胞核成像能力作了详尽的研究:研究发现9E-BHVC具有广范的适用性和光稳定性,能够特异的明亮的成像细胞核,而在细胞质中几乎没有荧光。对于固定后的动物细胞染色需要的浓度极低,染色时间很短,且在高浓度长时间的染色条件下能够着染活动物细胞。双染实验的结果证实,9E-BHVC在固定细胞和活细胞上染色细胞核的数量与经典的核酸染料（DAPI）表现出很好的一致性,因此,我们可以说:“9E-BHVC探针是和经典的商业单光子荧光探针DAPI具有相似染色能力的细胞膜半通透性的双光子核酸荧光探针”。本论文的意义在于为生命科学工作者们提供了一个细胞膜半通透性的、真正意义上的双光子核酸荧光探针。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 第一部分 前言
  • 一 双光子激光共聚焦荧光显微镜
  • 1 双光子激光共聚焦荧光显微镜的理论基础——双光子吸收
  • 2 TPM的仪器构造
  • 3 TPM的基本特性
  • 4 TPM实际应用中的优势
  • 二 双光子激光共聚焦荧光显微镜的应用进展
  • 1 单分子成像和检测
  • 2 薄样本和敏感系统中的应用
  • 3 用于多标记样本
  • 4 成像厚生物样本
  • 5 定点光活化笼锁化合物
  • 6 研究深组织中的生命功能网络
  • 7 非干扰性的观察胚发育
  • 8 医疗诊断上的应用
  • 三 双光子荧光探针
  • 1 双光子荧光探针的基本特性
  • 2 双光子荧光探针的发光机理
  • 3 双光子荧光探针的研究现状
  • 四 本论文研究的目的和意义
  • 第二部分 材料及方法
  • 一 实验材料
  • 1 待测试的双光子荧光探针和参比探针
  • 2 光谱测试的实验材料和仪器
  • 3 动物细胞培养的实验材料和仪器
  • 4 拟南芥愈伤组织原生质体样本制备的材料和仪器
  • 5 细胞毒性分析的实验材料和仪器
  • 二 实验方法
  • 1 双光子荧光探针的光谱分析
  • 2 染色样本的制备方法
  • 3 染色成像的实验方法
  • 4 细胞毒性分析的实验方法
  • 第三部分 实验结果
  • 一 咔唑系列核成像双光子荧光探针的设计
  • 二 咔唑系列荧光探针与DNA相互作用的研究
  • 1 咔唑系列荧光探针与DNA作用的光谱分析
  • 2 环境极性对咔唑系列荧光探针荧光光谱的影响
  • 3 粘度对咔唑系列荧光探针光谱的影响
  • 三 计算咔唑系列荧光探针的物理参数
  • 1 咔唑系列荧光探针的荧光量子产率
  • 2 咔唑系列荧光探针与DNA作用的结合常数和结合位点数
  • 3 固定激发波长下咔唑系列荧光探针的双光子吸收截面和活性吸截面
  • 4 咔唑系列荧光探针波长依赖的双光子吸收截面谱和活性吸收截面谱
  • 四 咔唑系列荧光探针的成像特性
  • 1 BMVC和9E-BHVC的细胞定位
  • 2 9E-BHVC作为核染料的广谱适用性
  • 3 9E-BHVC具有双光子激光激发的敏感性
  • 4 PH对9E-BHVC染色的影响
  • 5 9E-BHVC的染色速率和光稳定性
  • 6 9E-HVC和9E-BHVC的活细胞染色
  • 7 9E-BHVC的活细胞染色效率
  • 8 9E-BHVC长时间孵育HeLa细胞的染色结果
  • 9 捕捉HeLa细胞有丝分裂相
  • 10 凋亡药物处理后9E-BHVC染色细胞
  • 11 9E-BHVC染色植物原生质体
  • 五 BMVC和9E-BHVC的短期细胞毒性实验
  • 第四部分 讨论
  • 一 A-π-D-π-A型共轭结构在荧光探针设计中的应用
  • 二 咔唑系列荧光探针与DNA相互作用的复杂性
  • 三 乙基和羟乙基引入带来的结果
  • 四 9E-BHVC是具有双生物学窗口的荧光探针
  • 五 咔唑系列荧光探针具有作为环境荧光探针的潜力
  • 六 9E-BHVC作为双光子核成像探针在细胞水平的成像潜力
  • 小结
  • 第五部分 参考文献
  • 第六部分 图版
  • 第七部分 附录
  • 博士期间所取得的研究成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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